一种脂肪干细胞的原代分离培养方法技术

本发明专利技术公开了一种脂肪干细胞的原代分离培养方法，包括以下步骤：1)洗涤脂肪组织；2)在脂肪组织中加入等体积的I型胶原酶和胰蛋白酶的混合液体；3)加入FBS，盖上瓶盖后封口摇匀，离心；离心后弃上清液；4)用含有FBS的DMEM重悬沉淀，沉淀与含有FBS的DMEM的体积比为1:1，吹打均匀后形成细胞悬液；将细胞悬液接种至培养基中；5)把接种后的培养基培养；6)培养后，转移细胞培养箱中继续培养。本发明专利技术的所探索的酶解条件稳定、高效，脂肪组织被彻底酶解，各成分细胞被最大化的释放出来；在不影响ADSCs的活性的前提下，单位脂肪体积所获得的ADSCs的量相对稳定。

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪干细胞的原代分离培养方法
本专利技术涉及干细胞的分离培养方法，具体涉及一种脂肪干细胞的原代分离培养方法。
技术介绍
人源脂肪干细胞(Adipose-DerivedStemCells，ADSCs)是近年来从人体脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。ADSCs不仅可以定向分化为脂肪、软骨、心肌细胞等多种细胞；还可分泌多种促进血管生成因子、凋亡因子等多种具有生物学活性的细胞因子。此外，ADSCs还具有取材容易、获取量大、供体取材时痛苦较少等优点。目前已被广泛应用于组织工程及再生医学领域。人源脂肪干细胞的体外分离培养却一直是个难题。现有技术方法中，都是在酶解条件和培养条件上进行改进。但仍多采用机械法去除血管、单一酶消化法、使用裂解液裂解红细胞、采取流式分选干细胞等步骤，尽可能的获得较纯的ADSCs的细胞群；在培养时添加青-链霉素等抗生素，虽然起到一定的抗菌作用，但也对细胞造成不同程度的毒害。整个脂肪干细胞的分离培养过程操作纷繁芜杂，耗时费力、生产成本倍增。此外，经实际操作后发现效果并不是十分的理想，由于使用了较多的化学试剂，ADSCs在分离后活力较低、增殖速度慢；且细胞形态变异较大。使用低浓度的、单一的酶液对脂肪组织进行酶解，酶解不彻底导致脂肪干细胞无法被充分释放出来。总的来说，ADSCs的分离和培养方法都不尽人意。
技术实现思路
为解决现有技术存在的问题，本专利技术针对实践过程中出现的一些问题，在相关环节上做了一些改进，经过多次尝试，形成了一个相对较完善，可操作性强且耗时短的人源脂肪干细胞的消化分离体系和分离后细胞的培养方法。本专利技术的目的，旨在进一步优化酶解方案，简化操作过程，分离出高活性、高纯度的脂肪干细胞，还可进一步适应工业化生产。本专利技术工艺简单高效，结果具有稳定、可重复性的优点。此外，本专利技术还创造性的使用了较高浓度混合酶解液，不仅最大程度的提取出脂肪干细胞，同时还保证了脂肪干细胞的高活力。最后，由于操作步骤极大简化，污染机率降低，在不使用青-链霉素的前提下，污染率仍为0％。本专利技术目的通过以下技术方案来实现。一种脂肪干细胞的原代分离培养方法，包括以下步骤：1)抽取脂肪组织，清洗；2)在脂肪组织中加入等体积的I型胶原酶和胰蛋白酶的混合液体；其中混合液体中I型胶原酶和胰蛋白酶的质量百分数分别为0.05％～0.3％和0.01％～0.1％，充分混匀后消化30～60min；3)加入FBS，盖上瓶盖后封口摇匀，离心；离心后弃上清液；4)用含有FBS的DMEM重悬细胞沉淀，细胞沉淀与含有FBS的DMEM的体积比为1:1，吹打均匀后形成细胞悬液；将细胞悬液接种至含有FBS的高糖DMEM培养基中；5)把接种后的培养基转移至细胞培养箱中培养；6)培养24～72h后，吸弃皿内培养基，清洗后添加含有EGF和FBS的DMEM，转移细胞培养箱中继续培养。优选，步骤(2)所述消化是在37℃的恒温气浴摇床中进行，摇速为100～250r/min。优选，步骤(3)所述离心的转速为1000～1500rpm，离心时间为3～10min。优选，所述FBS的体积百分数为10％，所述EGF的浓度为10ng/mL。优选本专利技术最佳酶解方案：使用了等体积Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶酶的混合酶液(两者质量百分数分别为0.25％、0.05％)，酶解时间为50min、摇速为200转。本专利技术相对于现有技术所具有的优点及有益效果：1.本专利技术的所探索的酶解条件稳定、高效，脂肪组织被彻底酶解，各成分细胞被最大化的释放出来；在不影响ADSCs的活性的前提下，单位脂肪体积所获得的ADSCs的量相对稳定。2.本专利技术提供的方法简单、操作容易，对于仪器设备的要求不高，普通的超净台、低速离心机和摇床即可满足要求，更利于规模化生产制备。3.本专利技术不使用红细胞裂解液，避免了红细胞裂解液残留的问题。4.效率高、耗时短、提取的细胞活力高，例如，采用0.075％的Ⅰ型胶原酶、37℃、100R的酶解条件，脂肪组织酶解不彻底，ADSCs损失较大；本专利技术采用Ⅰ胶原酶和胰蛋白酶的混合酶液，脂肪组织在短时间被彻底酶解、ADSCs的获取率达到最大化。此外，分离出来的ADSCs的活力高接种后的ADSCs在三天后即可生长融合至80％-90％。附图说明图1为脂肪干细胞接种1d后贴壁的情况；图2为脂肪干细胞活力对比情况；图3为脂肪干细胞形态对比图；图4为两种酶解方案分离的脂肪干细胞成骨成脂诱导实验对比。具体实施方式实施例11)静置含有组织液的脂肪组织，待脂肪组织与液体自然分层后10mL移液管吸弃下方液体；用50mL注射器吸取等体积的PBS加入到脂肪组织中，盖上瓶盖后反复摇晃脂肪组织，静置5min；用25mL移液管吸弃脂肪组织下方溶液(重复一次)。2)一次性移液管将脂肪组织均移至50mL离心管中；加入等体积I型胶原酶和胰蛋白酶混合液(质量百分数浓度分别为0.25％、0.05％)，封口后上下颠倒瓶子摇晃，充分混匀。转移至37℃恒温气浴摇床中，200R消化50min3)每管加入1mLFBS，盖上瓶盖后封口摇匀，1500rpm/min，离心5min；离心后弃上清液。4)按照脂肪体积：10％FBS的DMEM＝1:1的比例，用含有10％FBS的DMEM重悬ADSCs沉淀，吹打均匀后形成细胞悬液；将悬液接种至含有10％FBS的高糖DMEM培养基中。5)把接种后的ADSCs转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养。6)培养48h后，吸弃皿内培养基，加入10mL/皿PBS清洗(重复2次)。添加10％FBS的DMEM、10ng/mLEGF，转移细胞培养箱中继续培养。实施例21)静置含有组织液的脂肪组织，待脂肪组织与液体自然分层后10mL移液管吸弃下方液体；用50mL注射器吸取等体积的PBS加入到脂肪组织中，盖上瓶盖后反复摇晃脂肪组织，静置5min；用25mL移液管吸弃脂肪组织下方溶液(重复一次)。2)一次性移液管将脂肪组织均移至50mL离心管中；加入等体积I型胶原酶和胰蛋白酶混合液(质量百分数浓度分别为0.05％、0.1％)，封口后上下颠倒瓶子摇晃，充分混匀。转移至37℃恒温气浴摇床中，100R消化30min3)每管加入1mLFBS，盖上瓶盖后封口摇匀，1000rpm/min，离心3min；离心后弃上清液。4)按照脂肪体积：10％FBS的DMEM＝1:1的比例，用含有10％FBS的DMEM重悬ADSCs沉淀，吹打均匀后形成细胞悬液；将悬液接种至含有10％FBS的高糖DMEM培养基中。5)把接种后的ADSCs转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养。6)培养24h后，吸弃皿内培养基，加入10mL/皿PBS清洗(重复2次)。添加10％FBS的DMEM、10ng/mLEGF，转移细胞培养箱中继续培养。实施例31)静置含有组织液的脂肪组织，待脂肪组织与液体自然分层后10mL移液管吸弃下方液体；用50mL注射器吸取等体积的PBS加入到脂肪组织中，盖上瓶盖后反复摇晃脂肪组织，静置5min；用25mL移液管吸弃脂肪组织下方溶液(重复一次)。2)一次性移液管将脂肪组织均移至50mL离心管中；加入等体积I型胶原酶和胰蛋白酶混合液(质量百分数浓度分别为0.3％、0.01％)，封口后上下颠倒瓶子摇晃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂肪干细胞的原代分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获得脂肪组织，清洗；2)在脂肪组织中加入等体积的I型胶原酶和胰蛋白酶的混合液体；其中混合液体中I型胶原酶和胰蛋白酶的质量百分数分别为0.05％～0.3％和0.01％～0.1％，充分混匀后消化30～60min；3)加入FBS，盖上瓶盖后封口摇匀，离心；离心后弃上清液；4)用含有FBS的DMEM重悬细胞沉淀，细胞沉淀与含有FBS的DMEM的体积比为1:1，吹打均匀后形成细胞悬液；将细胞悬液接种至含有FBS的高糖DMEM培养基中；5)把接种后的培养基转移至细胞培养箱中培养；6)培养24～72h后，吸弃皿内培养基，清洗后添加含有EGF和FBS的DMEM，转移细胞培养箱中继续培养。

【技术特征摘要】
1.一种脂肪干细胞的原代分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获得脂肪组织，清洗；2)在脂肪组织中加入等体积的I型胶原酶和胰蛋白酶的混合液体；其中混合液体中I型胶原酶和胰蛋白酶的质量百分数分别为0.05％～0.3％和0.01％～0.1％，充分混匀后消化30～60min；3)加入FBS，盖上瓶盖后封口摇匀，离心；离心后弃上清液；4)用含有FBS的DMEM重悬细胞沉淀，细胞沉淀与含有FBS的DMEM的体积比为1:1，吹打均匀后形成细胞悬液；将细胞悬液接种至含有FBS的高糖DMEM培养基中；5)把接种后的培养基转...

【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，陈海佳，葛啸虎，卢瑞珊，马岩岩，王小燕，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44