构建基因2a型丙型肝炎病毒临床分离株细胞培养模型的方法技术

本发明专利技术涉及一种构建基因2a型丙型肝炎病毒临床分离株细胞培养模型的方法。本发明专利技术还提供了能在病毒包装细胞中高效感染和复制的重组丙型肝炎病毒。本发明专利技术的技术方案可应用于对HCV病人的个性化治疗，开发具广谱活性的疫苗，筛选抗HCV的特异性药物等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术以及病毒学领域；更具体地，本专利技术涉及一种构建基因2a型 丙型肝炎病毒临床分离株细胞培养模型的方法。
技术介绍
HCV属于黄病毒科，是有包膜的单股正链RNA病毒。其基因组长9. 6kb，包括5'非 翻译区，开放阅读框及3'非翻译区。其开放阅读框编码一个多聚蛋白，经剪切后得到结构 蛋白（core，El，E2)，p7 及非结构蛋白（NS2,NS3,NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。HCV至少可划 分为6个基因型以及很多的亚型和分离株。基因型之间不仅有序列的差异，而且对抗病毒 治疗的应答也不同。Ib和2a是中国丙肝病人中最常见的基因型。由于HCV的RNA依赖的 RNA聚合酶保真度不高，HCV在宿主体内以准种形式存在，即许多在序列上高度同源但又有 差异的HCV变异株病毒群体。单基因组测序的结果显示HCV在慢性感染患者体内的序列差 异很大。 全球丙型肝炎病毒（HCV)感染率约3%。感染后约80%的患者会发展成慢性肝炎， 很有可能导致终末期肝病，如肝硬化和肝细胞癌。至今尚无疫苗。目前标准的治疗方案包括 聚乙二醇化干扰素a和利巴韦林联用，一些直接作用于HCV小分子抑制剂也被开发出来。 然而，因为病毒易产生耐药性，或不同HCV基因型或毒株对药物应答不同，常常无法建立持 续性病毒应答。因此，丙肝感染仍是当今世界的一个严重的公共卫生问题。HCV的体外培养模型对研究HCV生命周期及抗病毒药物开发至关重要。由于病人 血清在Huh7来源细胞系中无感染性，体外培养HCV必须得制备感染性cDNA克隆。JFH-I是 第一个被报道能在Huh7细胞系中有效产生病毒的HCV基因组（Kato,T?等，2001，Journal ofmedicalvirology64:334-339)。JFH-I的独特之处在于它可以不依赖细胞培养适应性 突变就能高效复制。借助于这个cDNA克隆，基于JFH-I或嵌合体J6/JFH-1的真病毒体外感 染模型才得以建立。随后，来源于其它基因型的5'非翻译区，5'非翻译区-NS2,NS3/NS4A 或NS5A的与JFH-I的嵌合病毒都相继被报道。但是，还需要基于对共有序列进行有限的突 变来构建高效HCV培养模型。 在筛选抗HCV的特异性药物或疫苗的过程中，由于不同HCV基因型或病毒株对药 物的应答可能有很大不同，因此，在尽量多的病毒株上，尤其是不同来源、不同抗药性的病 毒株上测试潜在药物或疫苗的效果就显得尤为重要。遗憾的是目前能够获得的具有在体外 培养系统中高效复制感染能力的病毒株还很有限，因此亟需找到更多的适用于体外筛药系 统的病毒株，以帮助寻找具有更广泛抗HCV病毒谱的潜在药物，或开发更有效的疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种构建基因2a型丙型肝炎病毒临床分离株细胞培养模 型的方法。 在本专利技术的第一方面，提供一种丙肝病毒的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO: 3有90%以上、优选的95%以上、更优的97%以上、最优的99%以上的相同性，并且所述 氨基酸序列具有选自以下至少一项条件或其任意组合：从N末端的氨基酸残基起算，第415 位氨基酸为D;第849位氨基酸为G;第862位氨基酸为P;第1388位氨基酸为H;第2100 位氨基酸为R;第2432位氨基酸为R;第2584位氨基酸为T;第2955位氨基酸为F。 在一个优选例中，所述的氨基酸序列还具有选自以下至少一项条件或其任意组 合：第1100位氨基酸为L;第1676位氨基酸为S;第1931位氨基酸为S;第2941位氨基酸 为V。 在另一优选例中，所述的丙肝病毒的氨基酸序列还具有选自以下至少一项条件或 其任意组合：从N末端的氨基酸残基起算，第249位氨基酸为R;第250位氨基酸为Q;第337 位氨基酸为V;第384位氨基酸为G;第390位氨基酸为A;第397位氨基酸为R;第401位 氨基酸为G;第402位氨基酸为F;第404位氨基酸为D;第405位氨基酸为V;第416位氨 基酸为T;第417位氨基酸为K;第439位氨基酸为A;第453位氨基酸为V;第925位氨基 酸为V;第1634位氨基酸为P;第1638位氨基酸为G;第2083位氨基酸为R;第2329位氨 基酸为M;第2374位氨基酸为G;第2375位氨基酸为P;第2392位氨基酸为I;第2439位 氨基酸为L;第2440位氨基酸为E;第2513位氨基酸为V;第2608位氨基酸为S。 在另一优选例中，所述的丙肝病毒的氨基酸序列具有SEQIDN0:3所示的氨基酸 序列。 在本专利技术的另一方面，提供编码所述的氨基酸序列的多核苷酸，所述的多核苷酸 为DNA或RNA。 在一个优选例中，所述的多核苷酸是DNA，其具有SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。 在本专利技术的另一方面，提供所述的蛋白或编码其的多核苷酸的用途，用于制备重 组丙型肝炎病毒株；或用于制备重组丙型肝炎病毒疫苗；或用于筛选抗HCV的特异性药物。 在本专利技术的另一方面，提供一种用于制备重组丙型肝炎病毒株的重组病毒质粒， 该重组病毒质粒包含所述的多核苷酸。 在本专利技术的另一方面，提供一种制备重组丙型肝炎病毒的方法，所述方法包括： (a)提供如所述的重组病毒质粒；(b)将步骤（a)的重组病毒质粒在体外转录合成RNA后， 转染病毒包装细胞，培养经转染的病毒包装细胞，获得重组丙型肝炎病毒株。 在另一优选例中，所述的病毒包装细胞是人肝癌细胞系；较佳地，所述的病毒包装 细胞包括但不限于：Huh7. 5. 1细胞、Huh7细胞、Huh7. 5细胞、HepG2、MY-N9;较佳地所述的 病毒包装细胞为Huh7. 5. 1细胞。 在本专利技术的另一方面，提供一种重组丙型肝炎病毒，所述的病毒具有所述的多核 苷酸组成的基因组。 在另一优选例中，所述的重组丙型肝炎病毒由前面所述的方法制备。 在本专利技术的另一方面，提供一种用于制备重组丙型肝炎病毒的试剂盒，所述试剂 盒中包括所述的重组病毒质粒。 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：病毒包装细胞。 本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。【附图说明】 图1、最大似然法分析得到的PR63的进化树。进化树采用Kimura两参数模型，以 MEGA5软件绘制。分析中包括的核苷酸序列有H77 (登录号AF009609)，JFH-I(AB047639)， HC-J6(D00944)，HCV-J(D90208)，Con-1(AJ238799)，HCV-J8 (D10988)，BEBEl(D50409)， J6CF(AF177036)，JFH-2 (AB690460)，PR63 共有序列（KF676351)和来源于细胞培养的 PR63cc基因组（KF676352)。PR63共有序列和PR63cc以星号标出。 图2、PR63CC基因组构建流程图。JFH-I和PR63的基因组分别以白色或灰色方框 表示。为了技术上的方便，我们将HCV的基因组分成3个片段：片段UFspAI-SpeI)含有 Core-NS3蛋白酶区域（核苷酸476-4111)，片段2(SpeI-RsrII)含有NS3解旋酶-NS5A 段（核苷酸4112-7465)，片段3(RsrII-SgrAI)含有NS5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丙肝病毒的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90%以上的相同性，并且所述氨基酸序列具有选自以下至少一项条件或其任意组合：从N末端的氨基酸残基起算，第415位氨基酸为D；第849位氨基酸为G；第862位氨基酸为P；第1388位氨基酸为H；第2100位氨基酸为R；第2432位氨基酸为R；第2584位氨基酸为T；第2955位氨基酸为F。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钟劲，卢捷，向禹，陶万银，王娜，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31