用于检测苯乙醇胺A的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种能识别苯乙醇胺A的特异性单克隆抗体，本发明专利技术还公开了一种用于检测苯乙醇胺A的酶联免疫方法及试剂盒。本发明专利技术的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201498的杂交瘤细胞株PEAA2D8所分泌的。与现有技术相比，本发明专利技术建立的ELISA方法和试剂盒对苯乙醇胺A的最低检测限(IC50)仅为0.63μg/L，对其它十余种β-兴奋剂没有交叉反应，显示出极高的检测灵敏度和特异性，能检测猪肉等动物性食品中苯乙醇胺A的痕量残留，具有检测误差小、精密度高、效率高等优点。

【技术实现步骤摘要】
用于检测苯乙醇胺A的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒
本专利技术属于兽药残留分析和免疫学
，具体涉及一种能识别苯乙醇胺A的单克隆抗体以及用于检测苯乙醇胺A的酶联免疫方法(ELISA)与试剂盒。
技术介绍
苯乙醇胺A(phenylethanolamineA,PEAA)又称克伦巴胺，是β-兴奋剂的一种，该药结构和生理功能上类似肾上腺素和去甲肾上腺素，通过与细胞膜上的β-肾上腺素能受体结合发挥作用。这类药物能加强脂肪分解，抑制脂肪的合成，减少动物机体的脂肪，同时也能促进蛋白质的合成，减少蛋白的分解等作用而广泛用于畜禽中，但其毒副作用较大，如果用于食品动物，易在动物组织中残留，可能通过动物食品而影响到人类的健康。为了保障食品安全，《饲料和饲料添加剂管理条例》有关规定，禁止在动物饮水和饲料中使用苯乙醇胺A。目前苯乙醇胺A的检测方法主要有质谱法、液质联用等，这些仪器分析方法虽然灵敏度高，但存在设备昂贵、不能大量用于基层等缺点。随着免疫方法学的快速发展，苯乙醇胺A的试剂盒和胶体金逐渐增多，必将使苯乙醇胺A的检测飞速发展。CN102735834A公开了一种检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒，所述试剂盒中含有苯乙醇胺A的特异性抗体；并公开了以苯乙醇胺A与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的鼠单克隆抗体，但是该单克隆抗体对苯乙醇胺A的检测灵敏度不高，其最低检测限(IC50)为2.4μg/L。CN103265440A公开了一种苯乙醇胺A半抗原，在水合肼、钯碳和氮气条件下将苯乙醇胺A苯环上的硝基转换成氨基，再重氮化法连接载体蛋白制备了几种苯乙醇胺A的多克隆抗体，最低检测限(IC50)分别为0.049、0.22、0.21、0.48μg/L。尽管这些抗体检测的灵敏度较高，但半抗原制备方法复杂，使用的原料是危险性较大的水合肼，合成条件苛刻；且制备的是无法连续生产的多克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种灵敏度高、特异性强、能识别苯乙醇胺A的单克隆抗体。本专利技术的第二个目的是利用该单克隆抗体，制备一种用于苯乙醇胺A检测的酶联免疫试剂盒。本专利技术的第三个目的是利用该试剂盒，建立一种能用于苯乙醇胺A非诊断目的检测的酶联免疫方法。本专利技术通过以下技术方案实现：一种能识别苯乙醇胺A残留的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCCNO:C201498的杂交瘤细胞株PEAA2D8所分泌的。上述杂交瘤细胞株PEAA2D8，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCCNO:C201498。制备所述的单克隆抗体所用的半抗原具有式(2)所示的结构式：将结构如式(2)所示的化合物与人血清白蛋白(HSA)偶联得到免疫原。进一步，本专利技术提供了一种能检测动物性食品中苯乙醇胺A残留的酶联免疫方法，该方法包括以下步骤：(1)将结构如式(1)所示的化合物与卵清白蛋白(OVA)偶联得到包被原；(2)用保藏号为CCTCCNO:C201498的杂交瘤细胞株PEAA2D8制备单克隆抗体；(3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；(4)将待测样品提取后进行酶联免疫检测。本专利技术以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了能检测苯乙醇胺A的酶联免疫检测试剂盒，结合上述酶联免疫方法，实现了对苯乙醇胺A的酶联免疫检测。本专利技术的主要优点是：1)本专利技术在抗体制备时，采用的半抗原充分暴露了抗原决定簇，由该抗原制备的单克隆抗体对苯乙醇胺A的识别灵敏度高、特异性强。2)本专利技术在包被原制备时，采用式(1)所示的化合物异源包被，进一步提高了抗体对苯乙醇胺A的识别灵敏度。3)本专利技术建立的ELISA方法和试剂盒对苯乙醇胺A的最低检测限(IC50)仅为0.63μg/L，对其它十余种β-兴奋剂没有交叉反应，显示出极高的检测灵敏度和特异性。4)本专利技术建立的ELISA方法能检测猪肉中苯乙醇胺A的微量残留，具有检测误差小、精密度高、效率高等优点。附图说明图1为本专利技术所使用的半抗原、人血清白蛋白(HSA)和免疫原(PEAA-SA-HSA)的紫外扫描图谱。图2为本专利技术所使用的半抗原、卵血清白蛋白(OVA)和包被原(RAC-SA-OVA)的紫外扫描图谱。图3为本专利技术的单克隆抗体与苯乙醇胺A标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为苯乙醇胺A标准溶液浓度对数值，Y轴为苯乙醇胺A标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步说明，但不限制本专利技术。实施例1免疫原和包被原的制备1.1免疫原PEAA-SA-HSA的制备称取4-(4-苯羟基)-2-丁酮16.4g溶于DMF50mL中，缓缓加入氢化钠3.4g和4-溴丁酸乙酯19.5g，60℃水浴中搅拌反应过夜。用薄层色谱检测原料药是否反应完全，用V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝3:1为展开剂。反应完全后，乙酸乙酯萃取有机相，再用无水硫酸钠干燥。用V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝4:1过柱纯化得到白色固体。称取上述白色固体7g和1-(4-甲氧基苯基)-2-氨基乙醇6g溶于甲醇，加入氰基硼氢化钠1.4g和三乙胺3mL，60℃反应过夜，旋蒸，加入一蒸水50mL和1mol/LHCl调节至pH值至4，乙醚除去有机相杂质。用NaOH溶液调节水相pH至12～13，再用乙酸乙酯萃取，旋蒸后有机相用无水硫酸钠干燥后得到混合物。称取上述混合物7g溶于甲醇30mL中，滴加2mol/LNaOH至pH值为10左右，室温反应过夜。旋蒸，加一蒸水50mL和1mol/LHCl调节pH值至3～4，水相有白色固体析出，过滤，水洗后烘干，得到半抗原PEAA-SA。准确称取PEAA-SA30mg溶于二甲亚砜0.2mL中，加入DCC20mg和NHS11mg，活化24h后，有机滤膜过滤除去沉淀。称取HSA40mg溶于PBS10mL中，将上步活化的反应液缓缓滴加到蛋白溶液中，冰浴反应过夜，使载体蛋白的氨基基团与PEAA-SA反应，透析3d，每天换2次透析液，透析后离心除去沉淀，低压冻干，即得偶联物PEAA-SA-HSA。1.2包被原RAC-SA-OVA的制备称取1.1中第一步反应后白色固体7g和章胺盐酸盐6g溶于甲醇，加入氰基硼氢化钠1.4g和三乙胺3mL，60℃反应过夜，旋蒸，加入一蒸水50mL和1mol/LHCl调节至pH值至4，乙醚除去有机相杂质。用NaOH溶液调节水相pH至12～13，再用乙酸乙酯萃取，旋蒸后有机相用无水硫酸钠干燥后得到混合物。称取上述混合物7g溶于甲醇30mL中，滴加2mol/LNaOH至pH值为10左右，室温反应过夜。旋蒸，加一蒸水50mL和1mol/LHCl调节pH值至3～4，水相有白色固体析出，过滤，水洗后烘干，得到白色固体RAC-SA。准确称取RAC-SA29mg溶于二甲亚砜0.2mL中，加入DCC20mg和NHS11mg，活化24h后，有机滤膜过滤除去沉淀。称取OVA44mg溶于PBS10mL中，将上步活化的反应液缓缓滴加到蛋白溶液中，冰浴反应过夜，使载体蛋白的氨基基团与RAC-SA反应，透析3d，每天换2次透析液，透析后离心除去沉淀，低压冻干，即得偶联物RAC-SA-OVA。实施例2单克隆抗体的制备杂交瘤细胞的制备：参照杨汉春《动物免疫学》，以实施例1制备的免疫原PEAA-SA-HSA偶联物免疫Bal本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能识别苯乙醇胺A的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C201498的杂交瘤细胞株PEAA2D8所分泌的。

【技术特征摘要】
1.一种能识别苯乙醇胺A的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCCNO:C201498的杂交瘤细胞株PEAA2D8所分泌的。2.一株杂交瘤细胞株PEAA2D8，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C201498，所述杂交瘤细胞株PEAA2D8分泌的单克隆抗体能识别苯乙醇胺A。3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒中的应用。4.包含权利要求1所述单克隆抗体的试剂盒。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁宗辉，王玉莲，赵兰，彭大鹏，潘源虎，陈冬梅，陶燕飞，刘振利，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42