一种扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体及制备方法技术

本发明专利技术属于动物基因工程领域，具体涉及一种扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体及制备方法。本发明专利技术分离的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的BGL1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。对扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白抗原表位预测分析,得到含抗原表位较多的片段，构建大肠杆菌重组表达载体，用该表达载体转化大肠杆菌，得到表达CB蛋白的重组株。对重组株进行诱导表达和对CB蛋白大量表达、纯化，以纯化的CB蛋白作扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体的免疫原免疫动物得到多克隆抗体。本发明专利技术的多抗特异性好，纯度和效价高，保存期长，可用于遗传工程中的免疫印迹、免疫组化分析等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物基因工程
，具体涉及一种扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体及制备方法。
技术介绍
扣囊复膜孢酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)，又称扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)，是真菌的一种，能够表达生淀粉液化酶和糖化酶，扣囊复膜孢酵母菌被认为是产生淀粉分解酶类的最好的子囊酵母菌之一。本专利技术中的β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，简称CB)是由来源于扣囊复膜酵母的BGL1基因表达产生的一种纤维素酶。纤维素酶是一个多酶组分的复杂酶系，广泛存在于自然界中，细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶，但一般用于生产的纤维素酶来自于真菌。纤维素酶主要由由内切葡萄糖苷酶、外切葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶三种酶组成。在降解纤维素所需的3三种酶中,β-葡萄糖苷酶所占比例最小,这直接影响了纤维素酶系的水解效率。因此，为了提高纤维素的利用率，近年来有关利用基因工程技术,提高β-葡萄糖苷酶表达效率的相关报道越来越多。扣囊复膜酵母菌的BGL1基因也应用于动物转基因技术，使BGL1基因在动物体内产生β-葡萄糖苷酶，旨在提高非反刍动物对饲料中纤维素的消化利用率。来源于扣囊复膜孢酵母菌的BGL1基因在基因工程领域中的应用报道也越来越多。目前市场上销售的β-葡萄糖苷酶抗体种类繁多，但无专门针对来源于扣囊复膜孢酵母菌的β-葡萄糖苷酶抗体。目前，本领域迫切需要制备出一种抗扣囊复膜孢酵母菌β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，CB)抗原的多克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种体外表达扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体及制备方法。本专利技术的技术方案如下所述：申请人通过克隆技术得到一种原核表达的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白，该扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。申请人提供了一种扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的体外原核表达方法，其包括下列步骤：(1)对扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白序列(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)进行抗原表位的预测与分析，该序列是SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列的表达产物；(2)预测分析选出一段抗原表位较多的氨基酸序列，所述的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所述，该序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的表达产物；(3)克隆如SEQ ID NO：3所示的的核苷酸序列，制备重组表达载体pET-21a(+)-BGL1；(4)将构建成功的重组表达载体pET-21a(+)-BGL1转化到大肠杆菌DH5α，构建得到表达CB蛋白的重组菌株；(5)对所得重组菌株进行诱导表达，并进行表达形式的检测；(6)对所得的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白进行大量表达及纯化，通过免疫动物得到得到抗血清，进一步纯化得到多克隆抗体。在上述步骤(3)中构建重组载体时，克隆扣囊复膜孢酵母菌BGL1基因的插入位点为EcoRI和XhoI酶切位点。在上述步骤(3)中构建重组载体时，所用的引物序列如下所示：正向引物F：5’—CCGGAATTCGGTGACAGATCCGGGACTGCT—3’(下划线部分为EcoR Ⅰ位点)，反向引物R：5’—CCGCTCGAGTCTCAAAAGCTCAAACTCAAC—3’(下划线部分Xho Ⅰ位点)。在上述步骤(5)中，诱导蛋白表达所用方法为自诱导培养基诱导蛋白的表达，所述的自诱导培养基成分如下所述：酵母提取物0.5％；Na2HPO450mM；KH2PO450mM；(NH4)2SO425mM；MgSO42mM；甘油0.5％；葡萄糖0.05％；乳糖0.2％。在上述步骤(6)中，所述纯化是用镍柱亲和层析法中的变性条件进行纯化，所述的变性条件如下：先用含8M尿素的Binding buffer平衡柱子，由于目的蛋白和杂蛋白对不同浓度的咪唑有不同的结合能力，所以用含8M尿素且有如下咪唑浓度的Wash buffer洗脱杂蛋白，最后用含8M尿素且有如下咪唑浓度的Elute buffer洗脱，最终收集到目的蛋白。所述的洗脱液成分如下所述。洗脱液成分本专利技术得到的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的C端带有6个组氨酸标签。作为优选方案，所述的免疫动物为新西兰兔。作为优选方案，所述纯化为蛋白A亲和纯化。作为优选方案，本专利技术还包括利用ELISA和Western Blot方法，对制备得到的抗扣囊复膜孢酵母菌CB抗原的多克隆抗体进行鉴定。本专利技术制备的多克隆抗体具有特异性好、纯度及效价高以及能长期保存等突出优点，可用于免疫印迹和免疫组化分析的相关领域中。附图说明序列表SEQ ID NO:1是扣囊复膜孢酵母菌CB抗原目的基因的部分核苷酸序列(1-2577bp)，同时该片段也是扣囊复膜孢酵母菌CB抗原目的基因对应编码的氨基酸序列(即CDS区，1-2577bp)，编码859个氨基酸序列。序列表SEQ ID NO:2是扣囊复膜孢酵母菌CB抗原目的基因编码的蛋白质序列。序列表SEQ ID NO:3是扣囊复膜孢酵母菌CB抗原目的基因含有较多抗原表位的核苷酸序列，序列长度为726bp(1-726bp)，也是该片段编码的氨基酸序列(1-726bp)；编码242个氨基酸序列。序列表SEQ ID NO:4是扣囊复膜孢酵母菌CB抗原目的基因含有较多抗原表位的蛋白片段编码的蛋白质序列。图1：是本专利技术的扣囊复膜孢酵母菌CB抗原目的基因的PCR扩增产物。附图标记说明：M：DNA分子量标准DL2000；泳道1-3：目的基因的PCR产物。图2：重组菌的PCR鉴定结果。附图标记说明：M：DNA分子量标准DL2000；泳道1-6：重组菌液；泳道7：阴性对照。图3：是pET-21a(+)-BGL1重组质粒的双酶切鉴定。附图标记说明：M：DNA分子量标准DL2000；泳道1-3：pET-21a(+)-BGL1重组质粒；方框标注的基因为目的基因。图4：利用ZYP-5052自诱导培养基诱导扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的表达。附图标记说明：M：蛋白分子标记；泳道1：诱导前菌体总蛋白；泳道2：诱导后菌体总蛋白。箭头所指为目的蛋白位置。图5：重组表达载体pET-21a(+)-BGL1表达产物的可溶性分析图。其中图5A：网站预测表达蛋白疏水性，分值在零以下为疏水性，得分在零以上为亲水性。图5B：通过鉴定获得的目的蛋白表达形式的SDS-PAGE图谱；附图标记说明：泳道0：诱导前菌体总蛋白；M：蛋白分子标记；泳道1：诱导后的菌体总蛋白；泳道2：超声波破碎后的上清；泳道3：超声波破碎后的沉淀；箭头所指本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种原核表达的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
1.一种原核表达的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所
示。
2.一种扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的原核表达方法，其特征在于如下步骤：
(1)对如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白进行抗原表位的预
测与分析；
(2)筛选得到一段抗原表位较多的片段，该片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(3)克隆SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，得到重组表达载体pET-21a(+)-BGL1；
(4)将重组表达载体pET-21a(+)-BGL1转化大肠杆菌DH5α，构建表达CB蛋白的重组菌
株；
(5)对重组菌株进行诱导表达，并进行表达形式的检测；
(6)对扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白进行大量表达及纯化，通过免疫动物得到得到抗血清，进
一步纯化得到多克隆抗体。
3.如权利要求2所述的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的原核表达方法，其特征在于，步骤
(3)构建重组载体时，克隆扣囊复膜孢酵母菌BGL1基因的插入位点为EcoRI和XhoI酶切
位点。
4...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋思文，李玉娇，彭健，柴进，李凤娥，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42