本发明专利技术公开了一种酯酶及其编码基因和应用，该酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术从假单胞菌Pseudomonas CGMCC NO.4184中克隆得到酯酶基因，该基因表达后获得的酯酶具有高表达量、高选择性和手性选择性的特点；本发明专利技术将包含酯酶基因的工程菌应用到催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制备2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯中，能够控制反应的转化率在超过50％时，即可获得未被水解的高纯度2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种酯酶及其编码基因和应用。
技术介绍
2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯是化学酶法合成普瑞巴林(Pregabalin，简称PGB，商品名为)的重要手性中间体。普瑞巴林是一种神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的三位异丁基取代物，其作为新一代抗癫痫药物，已被应用于治疗多种中枢神经系统紊乱疾病，包括神经病理性疼痛，社交性焦虑障碍，泛发性焦虑症和辅助性治疗局限性部分癫痫发作等。由于该药物相较于其他同类治疗癫痫病药物具有明显的优势，由辉瑞公司生产并上市销售的年销售额呈逐年攀升之势，在2011年、2012年和2013年分别高达36.9亿、41.6亿和46.0亿美元。由于只有S构型的普瑞巴林具有药理活性，因此，获取光学纯的中间体2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯在有效减少服用剂量、提高治疗窗口、减轻非活性对映体所致副作用等方面具有重要的意义。制备普瑞巴林主要有两类方法：一类是使用不对称催化剂、手性配体或者以手性化合物为原料的不对称合成法，另一类是使用化学手性拆分剂或者生物酶对外消旋反应中间体或外消旋普瑞巴林进行拆分的外消旋体拆分法。不对称合成法因需要昂贵的手性试剂，特殊的设备，苛刻的反应条件等，其应用受到了明显的限制。化学拆分法同样具有一些难以避免的缺陷，譬如反应步骤繁杂，劳动强度大，操作复杂，收率低，环境污染较大等。相比之下，生物拆分法则可有效避免这些问题，具备操作条件简单温和，对映选择性强，成本低，环境友好等优点，因此具有极大的开发潜力和广阔的应用前景。目前，不少生物催化法制备普瑞巴林的途径已见报道。例如，具有高活力和高对映体选择性(转化率为45％，产物对映体过量值eep为98％)的腈水解酶AtNit1，能够实现高效地立体选择性水解异丁基琥珀腈，得到中间体(3S)-3-氰基-5-甲基己酸。来自南极假丝酵母的脂肪酶CALB也被应用于立体选择性合成手性中间体(S)-或(R)-异丁基-戊二酸酯(收率为96％，ee值为95.5％)。基于过程效率和产品成本的考虑，这些路径目前并不能满足制备普瑞巴林的工业化应用要求。另外一条路径，即辉瑞公司利用商业脂肪酶选择性地水解2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，则成功实现了化学-酶法制备普瑞巴林的工业化生产。该方法所得到的2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸(转化率为45％-50％，ee值＞98％)的钠盐，经过后续化学反应步骤最终可制得(S)-普瑞巴林。这条工艺路线实现了手性中心的尽早确立以及2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的外消旋化再利用，大幅地减少了原料用量和废弃物产生量，使E因子由第一代(传统拆分)路线的86降至8。基于这条生物法拆分路线，其他作用于2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的酶或微生物陆续被开发和报道。如一株土筛得到的菌株KM8经紫外和硫酸二甲酯(DES)诱变，其转化率和eep值分别提高至76.1％和92.6％。另一株菌Morgarella morganii ZJB-09203及从中纯化得到的酯酶也被应用于选择性水解2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，当使用全细胞催化剂水解1.5M底物时，其转化率和eep值分别为45.3％和95％。来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶Lip经过定点突变改造，酶活得到大幅提高，在1M底物投入量下实现了42.4％的转化率和98％的eep值。然而，上述路线的酶法拆分都无法获取更高光学纯度(ee＞99％)的S型产物。因此，通过对映选择性水解2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯而留下未被水解的高光学纯度2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯是一种具有潜力的拆分选择。
技术实现思路
本专利技术提供了一种酯酶及其编码基因和应用，该酯酶具有高表达量、高选择性和手性选择性的特点。本专利技术提供了一种酯酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该酯酶(命名为EstZF172)是从假单胞菌Pseudomonas CGMCC NO.4184中克隆获得，由1146个碱基组成，能够催化酯酶水解生成酸和醇。本专利技术还提供了一种编码所述的酯酶的基因。作为优选，所述的基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术提供了一种包含所述基因的表达盒、重组载体和转化子。本专利技术还提供了一种所述的酯酶在催化酯类水解中的应用。具体地，所述的酯酶在催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制备2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯中的应用。本专利技术还提供了一种制备2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的方法，包括以下步骤：(1)制备包含所述基因的工程菌的静息细胞悬液；(2)往静息细胞悬液中添加rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯进行水解反应，经后处理，得到2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。所述的水解反应如下式所示：本专利技术所述的催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解的反应，实际上是将rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯中的R构型的2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解得到2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸和乙醇，从而使反应体系中剩下光学纯的S构型的2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯；水解反应结束后，将反应液离心以除去体系中的细胞，向离心上清液中添加适量NaCl，并用乙酸乙酯反复萃取多次，将萃取液合并后，在35℃下进行真空旋蒸除去萃取剂，分离获得高纯度的2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。在整个S构型的2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的制备过程中，rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯与静息细胞的用量比例，以及水解反应的温度和离子缓冲液的pH值都会对所述酯酶催化的水解反应的转化率有影响。作为优选，rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯与静息细胞的质量比为20～60∶1；所述水解反应的温度为20～55℃；水解反应过程中离子缓冲液的pH值为5～10.5。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术从假单胞菌Pseudomonas CGMCC NO.4184中克隆得到酯酶基因，该基因表达后获得的酯酶具有高表达量、高选择性和手性选择性的特点；(2)本专利技术将包含酯酶基因的工程菌应用到催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制备2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯中，当水解反应的转本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酯酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种酯酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的酯酶的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种包含权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体和转化子。
5.如权利要求1所述的酯酶在催化酯类水解中的应用。
6.如权利要求1所述的酯酶在催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制备2-羧
乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯中的应用。
7.一种制备2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的方法，包括以下...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨立荣，许方馨，吴坚平，徐刚，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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