减毒的猪流感疫苗及其制备和使用方法技术

本公开内容提供了减毒的猪流感毒株，特别是经由反向遗传学方法产生的那些，包含其的组合物，以及其生产和使用方法。相对于由相应的剧毒亲本病毒编码的HA蛋白质，减毒的毒株经改造为编码具有另外的糖基化位点的HA蛋白质。有利地，可以施用减毒的流感毒株。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过引用并入本申请要求于2012年7月17日提交的临时申请USSN 61/672,398的优先权，且通过引用将其整体并入本文。专利
本专利技术一般涉及减毒的病毒疫苗，特别是对猪提供抵抗由猪流感引起的感染/疾病的广泛、安全和有效保护的那些疫苗。本专利技术进一步涉及产生减毒病毒的方法，以及与减毒病毒的毒力减少相关的核酸变异的鉴定。本专利技术相应地涉及包含本专利技术的病毒例如减毒活病毒的免疫原性组合物或疫苗组合物。病毒还可以在组合物中被灭活；但病毒是减毒的活猪流感可以是有利的。本专利技术因此进一步涉及用于制备和/或配制此类组合物的方法；例如在合适培养基上或中培养或生长或繁殖病毒，收获病毒，任选地灭活病毒，且任选地与合适的兽医学或药学可接受的运载体、赋形剂、稀释剂或媒介物和/或佐剂和/或稳定剂混合。因此，本专利技术还涉及病毒在配制此类组合物中的用途。专利技术背景流感病毒具有逃避针对介导病毒进入的血凝素的(HA)的宿主体液免疫的许多机制。基因组区段的重排可以导致抗原转换，同时突变的逐步累积导致遗传漂变(Desselberger U等人，1978，Schild G等人，1974)。除了可以影响预先存在的抗体识别突变型HA的能力的HA抗原性表位中的突变之外，HA的N联糖基化中的突变可以通过改变围绕HA的寡糖层来促进抗体识别的病毒逃避(Schulze IT，1997)。聚糖残基可以限制一些抗体与其表位的结合，导致在称为聚糖屏蔽的现象中的抗体识别和免疫原性的丧失(Wanzeck K等人，2011，Wei C-J等人，2010)。另外，突变和遗传漂变优先在不受聚糖保护的HA球状头部中的位置处发生(Das SR等人，2010)。聚糖残基还影响受体结合且因此可以影响病毒复制动力学。流感病毒的进化经常包括糖基化位点的数目和位置的修饰(Long J等人，2011)。对于H3N2病毒，糖基化位点的数目在过去40年已从两个增加到十个(4)。然而，增加糖基化的HA已与小鼠中的毒力减少和降低的病毒适合度关联(Das SR等人，2011，Vigerust DJ等人，2007)。虽然增加糖基化可以使HA屏蔽中和抗体，但关于细胞受体的病毒亲和力强制性减少(Abe Y等人，2004，Das SR等人，2011)。此外，需要HA或神经氨酸酶(NA)中的代偿突变以平衡受体结合和释放活性(Wagner R等人，2000)。NA中的这些补偿突变已与对NA抑制剂的天然抗性的获得相关(Hensley SE等人，2011)。猪流感病毒的众多遗传和抗原上不同的谱系同时在猪中循环，包括β、γ和δ-簇H1N1和H1N2病毒，以及H3N2亚型(Lorusso A等人，2012)。δ-簇最初再分成两个亚簇(δ-I和δ-II)，然而，最近的工作证实代表至少三个抗原上不同的组的五个不同遗传亚簇(δ-A、δ-B、δ-C、δ-D、δ-E)(Hause BM等人，2011，Vincent AL等人，2009)。虽然当疫苗株匹配野外攻击病毒时，被杀死的病毒疫苗是有效的，但流感的快速突变率需要频繁毒株变化，以确保在疫苗株和循环病毒之间的遗传和抗原匹配。另外，猪中共循环的多重亚型和谱系经常要求五种或更多种疫苗株，以便包括每个类型的代表。引发广谱免疫的单一活疫苗提供在猪卫生计划中的显著进展。专利技术概述本专利技术的目的是提供减毒疫苗以及治疗和预防猪流感的感染的方法。在一个实施方案中，疫苗包含减毒的流感病毒，其已经修饰为表达相对于其亲本株具有另外糖基化位点的HA基因。在特定实施方案中，HA基因和/或基因产物具有与SEQ ID NOs:17和21；SEQ ID NOs:17和23；SEQ ID NOs:18和22；或SEQ ID NOs:18和24之间存在的相同的修饰。在另外一个实施方案中，HA基因和/或基因产物具有5种修饰中的至少1种。在更特定的实施方案中，HA基因和/或基因产物具有4或5种修饰，导致相对于亲本HA基因产物的+4和+5个糖基化位点。本专利技术的另一个目的是提供用于反向遗传学系统中的cDNA和/或质粒，用于产生根据本公开内容的减毒流感。在一个实施方案中，cDNA和/或质粒中的至少一种包含相对于如SEQ ID NO:18所示的序列具有增加数目的糖基化位点的HA序列。在特定实施方案中，HA序列如SEQ ID NO:21或23中所示。本专利技术进一步涉及新的流感减毒株，其提供安全、有效和广泛的保护性免疫。相对于亲本流感毒株，减毒株可以具有由其HA基因编码的另外的糖基化位点和/或假定糖基化位点，所述糖基化位点的存在与毒力降低相关。因此，本专利技术提供了相对于野生型/亲本病毒，在一种或多种核酸序列中包含突变的突变型病毒，所述突变致使突变型病毒相对于亲本病毒是减毒的，所述亲本病毒包含编码野生型HA蛋白质的核酸。如本文定义的，“野生型”HA蛋白质是相对于如SEQ ID NO:18所示的序列，具有相同数目的糖基化位点和/或假定糖基化位点的蛋白质。在特定实施方案中，突变型病毒包含vRNA核酸序列，其对应于(即，是反向互补的且具有尿嘧啶代替胸苷)SEQ ID NO:21或23所示的DNA序列，所述DNA序列分别编码如SEQ ID NO:22或24所示的肽，并且促使突变型病毒相对于剧毒野生型/亲本病毒是减毒的/无毒力的。如本文定义的，术语“基因”将以广义使用，并且应涵盖编码和非编码序列两者(即上游和下游调节序列、启动子、5’/3’UTR、内含子和外显子)。当预期仅提及基因的编码序列时，术语“基因的编码序列”或“CDS”在本公开内容自始至终可互换使用。当讨论特定核酸例如如SEQ ID NO:17所示的序列(亲本病毒cRNA“有义”链的DNA序列等价物)时，技术人员将立即拥有该序列的所有可衍生形式(mRNA、vRNA、cRNA、DNA、蛋白质等)。例如，流感病毒是负单链RNA病毒(ssRNA)。为了复制，它的负ssRNA(本文定义为“vRNA”)必须转录为正或有义RNA(本文定义为“cRNA”)。宿主细胞机制共选择以使用cRNA产生病毒蛋白质和vRNA。技术人员使用众所周知的遗传密码可以照常规由DNA序列衍生vRNA、cRNA和肽序列。在特定实施方案中，减毒疫苗包含佐剂。佐剂可以是与单独的减毒疫苗相比较，增加和/或增强引发的免疫原性的任何物质。粘膜佐剂包括壳聚糖及其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种减毒的猪流感毒株，其能够在猪中提供针对流感或由流感引起的疾病的安全有效的免疫应答。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.07.17 US 61/672,3981.一种减毒的猪流感毒株，其能够在猪中提供针对流感或由流感
引起的疾病的安全有效的免疫应答。
2.权利要求1的毒株，其编码相对于剧毒亲本株具有至少1个另
外的糖基化位点的HA基因。
3.权利要求2的毒株，其编码相对于剧毒亲本株具有至少4个另
外的糖基化位点的HA基因。
4.权利要求3的毒株，其中所述糖基化位点选自S71N、K90N、
L173T、P287T和K294T，并且其中所述氨基酸变化的位置是基于由
具有如SEQ ID NO:18所示的序列的剧毒亲本株编码的HA基因。
5.权利要求4的毒株，其编码具有如SEQ ID NO:22所示的序列
或与SEQ ID NO:22具有至少90％同源性的序列的HA蛋白质，条件
是下述位置具有下述氨基酸：71N、90N、173T、287T和294T。
6.权利要求5的毒株，其中所述HA蛋白质具有如SEQ ID NO:22
所示的序列。
7.权利要求4的毒株，其编码具有如SEQ ID NO:24所示的序列
或与SEQ ID NO:24具有至少90％同源性的序列的HA蛋白质，条件
是下述位置具有下述氨基酸：71N、90N、173T、287T。
8.权利要求7的毒株，其中所述HA蛋白质具有如SEQ ID NO:24
所示的序列。
9.一种免疫组合物，其包含权利要求4-8中任一项的减毒株。
10.权利要求9的组合物，其进一步包含药学或兽医学可接受的
媒介物、稀释剂或赋形剂，并且其在猪中提供针对剧毒猪流感攻击的

【专利技术属性】
技术研发人员：B·M·豪斯，
申请(专利权)人：梅里亚有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US