本发明专利技术提供了用于检测金鱼造血器官坏死病病毒试剂盒。本发明专利技术首先提供了用于检测金鱼造血器官坏死病病毒的实时荧光定量PCR引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQID NO4所示。本发明专利技术还提供了使用上述引物和探针进行荧光定量PCR检测金鱼造血器官坏死病病毒的方法。本发明专利技术的检测方法及其检测试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。
【技术实现步骤摘要】
检测金鱼造血器官坏死病病毒的试剂盒及其应用
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测金鱼造血器官坏死病病毒的荧光定量PCR引物和探针，本专利技术还涉及利用该引物和探针进行金鱼造血器官坏死病病毒检测的方法和试剂盒。
技术介绍
金鱼造血器官坏死病病毒(goldfishhaematopoieticnecrosisvirus,GFHNV)，也称为鲤疱疹病毒-2(cyprinidherpesvirus2，CyHV-2)，是金鱼造血器官坏死病(goldfishhaematopoieticnecrosis，GFHN)的病原，是一种感染金鱼(Carassiusauratus)、鲫(Carassiusauratus)及其变种的高致病性双链DNA病毒。该病毒曾在日本、澳大利亚、新西兰、英国、匈牙利及我国台湾爆发疫病，发病金鱼死亡率可达100％。目前，国内外缺乏对GFHNV敏感的细胞系以及抗GFHNV的抗体,因此无法使用病毒分离和免疫学方法检测该病毒。对该病毒的检测方法的研究主要集中于建立分子生物学检测方法检测病毒核酸，包括PCR方法、荧光定量PCR方法和环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法。目前报道的针对GFHNV的PCR检测方法，其检测限低于荧光定量PCR检测方法和LAMP检测方法，而且需要对扩增产物进行凝胶电泳才能观察结果，易造成溴化乙锭污染；LAMP检测方法如果反应时间过长，容易产生假阳性，且由于产物过多，也容易造成核酸污染；目前报道的某些荧光定量PCR检测方法不稳定，检测结果有时会产生假阴性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于检测金鱼造血器官坏死病病毒的特异性引物和探针。本专利技术的另一个目的在于提供检测金鱼造血器官坏死病病毒的荧光定量PCR方法及其试剂盒。为实现上述目的，本专利技术对已知金鱼造血器官坏死病病毒特异基因的DNA序列进行比对，筛选出金鱼造血器官坏死病病毒基因的特异序列，即GFHNV主衣壳蛋白(MCP)基因中一段保守序列(2307-2464)，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供用于检测金鱼造血器官坏死病病毒上述特异序列的引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。其中，探针5’标记荧光基团FAM，3’标记TAMRAN。该特异引物扩增产物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一个实施方式中，优选的引物序列为：上游引物：CAAACCCAGCACCGTCAGATGGT(SEQIDNO.2)下游引物：ATCCGGCACAGGTGGCGTGT(SEQIDNO.3)。荧光探针序列为：5’-FAM-TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAG-TAMRAN(SEQIDNO.4)。本专利技术提供了上述引物和荧光探针在制备检测金鱼造血器官坏死病病毒试剂盒中的应用。本专利技术提供一种金鱼造血器官坏死病病毒的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品总DNA为模板，利用本专利技术提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。本专利技术的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为25μL反应体系时，其优选配置为：本专利技术的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性30s，55～65℃退火30s，40个循环。本专利技术优选的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性30s，59℃退火30s，40个循环。本专利技术每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：Ct值≤38.0时样品结果为阳性；Ct值＞38.0的样品结果为阴性。本专利技术提供了一种用于金鱼造血器官坏死病病毒检测的试剂盒，其包括上述能特异地扩增出如SEQIDNO.1所示核苷酸序列或其特异性片段的引物以及配合引物使用的Taqman探针。本专利技术试剂盒的所用引物序列为：上游引物：CAAACCCAGCACCGTCAGATGGT(SEQIDNO.2)下游引物：ATCCGGCACAGGTGGCGTGT(SEQIDNO.3)。荧光探针序列为：5’-FAM-TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAG-TAMRAN(SEQIDNO.4)。本专利技术提供的试剂盒，还包括DNA裂解液，荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为金鱼造血器官坏死病病毒基因组DNA。本专利技术提供了用于检测金鱼造血器官坏死病病毒的特异性引物和探针，建立了检测金鱼造血器官坏死病病毒的荧光定量PCR方法，具有很高的检测灵敏度，可以检测到100个拷贝的金鱼造血器官坏死病病毒DNA；该方法特异性强，其重复性好，可作为检测临床标本的手段，提高金鱼造血器官坏死病病毒检测的阳性率，操作简单，检测过程仅需90分钟，大大缩短检测周期，检测结果使用荧光定量PCR仪直接观察，不存在溴化乙锭污染的问题。本专利技术提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针和阴性、阳性对照，该试剂盒的推广应用将为防治和监测金鱼造血器官坏死病病毒病提供技术支持。附图说明图1为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR特异性评价，图中曲线为金鱼造血器官坏死病病毒的反应曲线；图2为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR检测限测定(1)，图中4-10号曲线，分别依次对应DNA模板量为104拷贝-1010拷贝的反应体系扩增出的反应曲线。图3为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR标准曲线(1)图4为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR检测限测定(2)，图中1-5号曲线，分别依次对应DNA模板量为101拷贝-105拷贝的反应体系扩增出的反应曲线。图5为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR标准曲线(2)具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1金鱼造血器官坏死病病毒特异性引物和探针的设计对已知金鱼造血器官坏死病病毒特异基因的DNA序列进行比对，筛选出金鱼造血器官坏死病病毒基因的特异序列，即GFHNV主衣壳蛋白(MCP)基因中一段保守序列(2307-2464)，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。设计引物与探针时，注意避开序列的突变点，经反复筛选和验证，得到一对用于检测金鱼造血器官坏死病病毒的荧光定量PCR引物和与引物配合使用的探针，上游引物：CAAACCCAGCACCGTCAGATGGT(SEQIDNO.2)下游引物：ATCCGGCACAGGTGGCGTGT(SEQIDNO.3)。荧光探针序列为：5’-FAM-TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAG-TAMRAN(SEQIDNO.4)。实施例2检测金鱼造血器官坏死病病毒的荧光定量PCR检测方法的建立1、作为阳性对照的重组质粒构建。将目的基因连接入T载体，连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑技术筛选重组质粒。使用商业化质粒提纯试剂盒提纯重组质粒。每组样品都设立1个阳性对照样品和阴性对照样品。阳性对照样品为上述重组质粒；阴性对照样品为去离子水。2、根据Ct值和荧光信号的强弱来判断优化条件，把最佳的条件组合起本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测金鱼造血器官坏死病病毒的特异性引物，其扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测金鱼造血器官坏死病病毒的特异性引物，其扩增产物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；其核苷酸序列为：上游引物：CAAACCCAGCACCGTCAGATGGT，下游引物：ATCCGGCACAGGTGGCGTGT。2.与权利要求1所述特异性引物配合使用的荧光探针，其核苷酸序列为：5’-FAM-TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAG-TAMRAN。3.权利要求1所述的引物和权利要求2所述的荧光探针在制备检测金鱼造血器官坏死病病毒试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：张旻，景宏丽，王娜，吴绍强，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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