一种厌氧菌的分离培养方法技术

本发明专利技术公开了一种厌氧菌的分离培养方法，包括培养基的配制、培养基灭菌前充氮气、菌种的富集培养和菌种的分离培养；其中菌种的分离培养采用液体培养基与固体培养基交替接种培养的方式，液体培养基向固体培养基接种采用毛细玻璃管穿刺接种，在固体培养基中形成一个接种面光滑的圆柱状厌氧培养腔，接种后采用未凝固的培养基将固体培养基表面形成的圆孔密封，从而形成密封的厌氧培养腔，厌氧培养腔的内壁为厌氧菌的培养面。本发明专利技术方法在固体培养基中形成接种面平整光滑的厌氧培养腔，为厌氧菌的培养提供厌氧环境，减少了厌氧设备的使用，简化了分离过程，节省了分离过程费用，缩短了获得单菌株时间。

【技术实现步骤摘要】
一种厌氧菌的分离培养方法
本专利技术涉及微生物领域，特别是涉及石油生产回用水、油田污水及含油污泥中厌氧菌的分离培养方法。
技术介绍
在石油化工行业中，微生物引起的腐蚀导致了巨大的经济损失。有文献报道，油井中75%以上的腐蚀、埋地管道和线缆中50%的故障来自微生物的腐蚀（主要是硫酸盐还原过程）；另有2008年的相关文献报道，在我国，每年由于腐蚀对油田造成的损失高达2亿元。随着多数陆上油田的开采进入中、后期，为提高采出率注水、注蒸汽及油田回注水的量均在逐年增加，采出原油的含水率也在增高，为了防止微生物腐蚀就需要在油田生产用水中投加更多的化学杀菌剂，由于微生物进化速度快，对环境的适应能力强，往往导致长期使用的杀菌剂效力下降，同时大量杀菌剂的投加又引起油田污水处理的难度增强。所以，微生物对油田造成的损失正在逐年上升。石油生产过程中引起腐蚀的微生物可分为厌氧和好氧两大类，在实际生产环境中，细菌群体中多种厌氧菌与好氧菌共存一起，好氧与厌氧腐蚀一般会同时发生，引起腐蚀的微生物主要有：硫酸盐还原菌（发生硫酸盐还原过程）、硫氧化菌、腐生菌、铁细菌和真菌。有文献报道，其中的硫酸盐还原菌不仅会造成设备腐蚀，同时由于其代谢过程中产生硫化氢，有潜在的人身安全危害，而油田上由于硫化氢引起的安全事故也屡见报道。要防止微生物引起的腐蚀，同时尽量减少化学杀菌剂对环境的污染，就要从研究微生物的生理特性着手，寻找抑制其生长繁殖的因素。所以，首先要从生产环境中分离出引起危害的微生物，其中好氧微生物的分离比较简单。而传统的厌氧菌分离培养方法，如厌氧罐、hungate滚管法和厌氧工作站中夹层培养等方法，操作复杂，过程耗时长，且费用较高。CN200710064715.3公开了一种厌氧菌的分离培养方法，该方法在整个操作过程中避免了目的微生物与氧气的接触，操作成本相对低廉，尤其适于生长温度高于50℃且对厌氧环境要求严格的难分离高温厌氧菌、严格厌氧菌的分离培养。该方法只需在厌氧菌分离的部分操作时使用厌氧工作站，培养时可以使用普通培养箱，无需继续提供厌氧环境，避免了分离培养时一台厌氧工作站只能用于一种生长温度的细菌的情况。但是，该专利技术利用未凝固琼脂（温度高于50℃）的培养基与细菌富集液混合的方式接种，对于生长环境温度低于50℃的厌氧菌，该专利技术所述的接种过程会影响待分离微生物的活性，甚至导致其死亡。
技术实现思路
本专利技术提供一种厌氧菌的分离培养方法。本专利技术方法在固体培养基中会形成接种面平整光滑的厌氧培养腔，为厌氧菌的培养提供厌氧环境，减少了厌氧设备的使用，简化了分离过程，节省了分离过程的费用，缩短了获得单菌株的时间。本专利技术厌氧菌的分离培养方法，包括培养基的配制、培养基灭菌前充氮气、菌种的富集培养和菌种的分离培养；其中菌种的分离培养采用液体培养基与固体培养基交替接种培养的方式，液体培养基向固体培养基接种采用毛细玻璃管蘸取待分离菌液穿刺接种，在固体培养基中形成一个接种面光滑的圆柱状厌氧培养腔，接种后采用未凝固的培养基将固体培养基表面形成的圆孔密封，从而形成密封的厌氧培养腔，厌氧培养腔的内壁为厌氧菌的培养面；固体培养基向液体培养基接种是将接种针伸入到厌氧培养腔内，从培养面上挑取形成的单菌落接入液体培养基。本专利技术中，所述的培养基的配制，根据待分离厌氧菌的原处环境，确定相应的培养基的组成和配比。本专利技术中，所述培养基灭菌前充氮气，目的是除去培养基中的氧气，为厌氧菌的生长提供厌氧环境。本专利技术中，所述菌种的富集培养是将菌种先进行活化，然后在相应的液体培养基经过2~5次转接获得富集菌液。接种不用在厌氧工作站中进行，只需要用灭菌后的针管刺入培养瓶上的胶塞接种吸取相应量的菌液。初次活化接种时为保证成功率，接种量占培养基体积的10%~20%。获得菌液之后，液体培养基之间的接种量占培养基体积的5%~10%。接种过程要迅速以减少菌液在空气中的暴露时间，接种完毕后立即蜡封即可。本专利技术中，所述菌种的分离培养是将富集菌液梯度稀释后向固体培养基接种的过程，需要在厌氧工作站中进行，接种完毕后加胶塞，并在移出厌氧工作站之后立即蜡封。培养瓶的蜡封用于对接种完毕后培养瓶胶塞与瓶口之间进行密封，避免空气的进入，维持长时间培养过程中培养瓶内的厌氧环境。本专利技术中，富集菌液向固体培养基穿刺接种时，接种量为用毛细玻璃管在稀释好的菌液中蘸取一次即可。所述的毛细玻璃管规格为外径2.0~4.0mm，内径1.5~3.0mm，长度10~20cm，可以向生产厂家定制或购买标准规格。由于毛细玻璃管壁薄中空，在穿刺接种过程中能带出进入毛细玻璃管中的培养基，而不会破坏固体培养基的整体性，并且能在固体培养基中形成接种面平整光滑的厌氧培养腔，这样有利于挑菌时对单菌落的辨识。所述的毛细玻璃管穿刺接种时最好触及培养瓶的底部或内壁，这样做能更好地借助毛细玻璃管带出其中的培养基，有利于形成一个完整的、接种面光滑的圆柱状厌氧培养腔。毛细玻璃管穿刺接种时最好与培养基表面倾斜，这样有利于菌落的挑取。本专利技术中，穿刺接种后在固体培养基表面会形成一个圆孔，圆孔直径与毛细玻璃管的内径有关。圆孔的密封可以采用滴管或移液枪在培养基表面圆孔上滴数滴未凝固培养基形成密封层，由于未凝固培养基遇到固体培养基后很快冷却凝固，不会接触到厌氧腔体内的接种面，从而不会破坏厌氧培养腔。对于生长温度较低的厌氧菌，本专利技术的接种过程不会因为温度过高影响待分离厌氧菌的活性或导致其死亡。本专利技术方法适用于原生长环境在10-60℃的菌种，分离过程与培养过程均可以很好的保持原生长温度。本专利技术中，挑取单菌落时，所述培养基表面圆孔的密封层，可以先用灭菌后的镊子去除，然后利用接种针挑取单菌落。本专利技术中，培养温度可根据待分离菌种原生长环境确定，可以在10~60℃培养3~7天。本专利技术中，培养瓶采用厌氧菌培养瓶，优选利用医用废弃的玻璃输液瓶，为节约培养基的用量富集培养过程可以利用50mL的输液瓶，分离培养可以利用100mL的输液瓶，用过的输液瓶清洗、灭菌后可以多次重复使用。与现有技术相比，本专利技术具有如下突出效果：1、利用毛细玻璃管实现从液体培养基向固体培养基穿刺接种，在固体培养基中形成一个接种面光滑的圆柱状厌氧培养腔，接种后采用未凝固的培养基将固体培养基表面形成的圆孔密封，从而形成密封的厌氧培养腔，本专利技术方法提供了厌氧菌生长的厌氧环境，不会影响菌体的生物活性，并且易于单菌落的辨识与挑取，缩短了获得单菌株的时间。2、本专利技术只有从液体培养基向固体培养基利用毛细玻璃管接种的过程和从固体培养基向液体培养基挑取单菌落的过程需要在厌氧工作站中进行，减少了对厌氧工作站的使用。接种后菌种的培养只需在普通培养箱进行培养，不需要专门的厌氧培养设备，培养温度的调节更方便，避免了分离培养时一台厌氧设备只能用于一种生长温度的菌体的情况，节省了厌氧菌分离过程的费用。3、与平皿夹层培养相比，本专利技术避免了未凝固固体培养基的高温对厌氧菌的活性的影响，有利于保持菌种分离、培养环境温度的一致性。与培养基表面蜡封方式相比，节省了耗材，并且在菌种转接过程中操作更方便，加速了厌氧菌的分离过程。本专利技术在人工操作上难度降低，减少了厌氧菌培养分离过程中对厌氧工作站的依赖，从而节约了耗材（如氮气）。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种厌氧菌的分离培养方法，包括培养基的配制、培养基灭菌前充氮气、菌种的富集培养和菌种的分离培养；其中菌种的分离培养采用液体培养基与固体培养基交替接种培养的方式，液体培养基向固体培养基接种采用毛细玻璃管吸取待分离菌液穿刺接种，在固体培养基中形成一个接种面光滑的圆柱状厌氧培养腔，接种后采用未凝固的培养基将固体培养基表面形成的圆孔密封，从而形成密封的厌氧培养腔，厌氧培养腔的内壁为厌氧菌的培养面；固体培养基向液体培养基接种是将接种针伸入到厌氧培养腔内，从培养面上挑取形成的单菌落接入液体培养基。

【技术特征摘要】
1.一种厌氧菌的分离培养方法，包括培养基的配制、培养基灭菌前充氮气、菌种的富集培养和菌种的分离培养；所述菌种的富集培养是将菌种先进行活化，然后在相应的液体培养基之间经过2~5次转接获得富集菌液，接种不用在厌氧工作站进行；其中菌种的分离培养采用液体培养基与固体培养基交替接种培养的方式，液体培养基向固体培养基接种采用毛细玻璃管吸取待分离菌液穿刺接种，在固体培养基中形成一个接种面光滑的圆柱状厌氧培养腔，接种后采用未凝固的培养基将固体培养基表面形成的圆孔密封，从而形成密封的厌氧培养腔，厌氧培养腔的内壁为厌氧菌的培养面；首先将富集菌液梯度稀释后向固体培养基接种，需要在厌氧工作站中进行，接种完毕后加胶塞，并在移出厌氧工作站之后立即蜡封，转至普通培养箱培养，培养3-7天后，固体培养基中长出菌落；固体培养基向液体培养基接种是在厌氧工作站中将接种针伸入到厌氧培养腔内，从培养面上挑取形成的单菌落接入液体培养基，接种完...

【专利技术属性】
技术研发人员：张胜中，王红涛，王阳峰，薄德臣，王海波，徐宏，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11