本发明专利技术克隆表达并公开了一种来源于假单胞菌的单加氧酶PMO-6814及其应用。具体涉及从假单胞菌基因组中克隆单加氧酶PMO-6814的编码基因，并构建表达载体导入大肠杆菌内，得到的一种具有单加氧酶活性的基因工程菌。该单加氧酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，相应的编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。该酶蛋白重组表达后能有效催化硫醚底物生成亚砜，具有较高的转化效率和立体异构对映选择性，可用于手性亚砜类药物的生物合成。
【技术实现步骤摘要】
一种源自假单胞菌的硫醚单加氧酶及其合成应用一种源自假单胞菌的硫醚单加氧酶及其合成应用
一般地，本专利技术涉及生物催化与生物合成和分子生物学领域。具体地，本专利技术涉及在生物催化与生物合成领域应用单加氧酶基因进行手性药物的合成。本专利技术还涉及单加氧酶基因克隆及重组蛋白表达的方法。
技术介绍
手性亚砜类化合物是许多药物如抗肿瘤药UstiloxinA、抗消炎药舒林酸，治疗胃溃疡药奥美拉唑，抗菌素司帕索霉素等合成过程中的关键中间体，在药物合成中有非常广泛的应用。目前，除了一些过渡金属催化剂如钛、钒能有效催化硫醚底物的不对称氧化反应生成手性亚砜外，大多数化学催化剂在催化反应中还存在过度氧化、副产物多和反应条件苛刻等不足，且这些化学催化反应体系通常使用重金属催化剂和过氧酸及双氧水等强氧化剂，不利于环境保护和可持续性发展的需求。而生物酶催化硫醚底物的不对称氧化反应可以直接形成手性中心，是合成手性亚砜类化合物最方便直接的技术手段。另外，通过酶催化硫醚底物氧化合成手性亚砜类化合物，还具有选择性高、环境友好等特点。鉴于此，生物催化的硫醚不对称氧化反应可望发展成为工业化绿色制备手性亚砜类药物的新型生物制造技术。但是，现有研究表明，具有高活性，高对映选择性和高底物耐受性的硫醚单加氧酶还十分匮乏。无论是利用分离后的单加氧酶、产硫醚单加氧酶菌株，还是重组表达硫醚单加氧酶的基因工程菌，催化效率都很低，无法满足绿色工业化生产的需求。因此，本专利技术的目的是筛选和获得高活性单加氧酶用于手性亚砜类化合物的生物合成。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种单加氧酶及其在手性亚砜类化合物生物合成中的应用。本专利技术所提供的单加氧酶，来源于由本实验室从土壤中分离获得一株假单胞菌菌株（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCCNO.M2013683），命名为PMO-6814，是由序列表中序列SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；SEQIDNo.1、蛋白序列MQTVEHEYKTIDPMALRRAFGTFVTGVTVVTTRDEQGSPRGMTANSFTSVSLDPALLLVCIGKGAASYPVFLQADSFAVNLLHEGQVALSNVFASKAPDKFDQVSHVAVHTGAPVLTDCLTWFDCTVHQCIDAGDHIILLGQVQAFGTSPEAPLGFCRGRYAQVKDPLPPGWLSASDMITGYLIESEGRLLLAEDGKGGWVLPTASRRLKDGRLPLSVGGELALLPDDTFLYSVFDTADNDPGYLIYRAKLAETLVEGALPPSLRFFALDQLPYSAIASHEIRAMLQRYARETERGSFGIYMDSQEGGRVAMVGSAQSWDKAY序列表中的序列SEQIDNo.1由323个氨基酸残基组成。为了便于序列SEQIDNo.1蛋白的纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列上述PMO-6814可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行重组表达得到。上述PMO-6814的编码基因可通过将序列表中序列SEQIDNo.2所示的DNA序列，和/或在其5´端和/或3´端连上表1所示的标签的编码序列得到。所述单加氧酶（PMO-6841）的编码基因也属于本专利技术的保护范围。所述单加氧酶（PMO-6841）编码基因的序列为如序列表中序列SEQIDNo.2所示的DNA分子；SEQIDNo.2、基因组DNA序列ATGCAGACCGTTGAACACGAATACAAGACGATAGACCCAATGGCCCTGCGCCGTGCCTTCGGTACGTTCGTCACCGGGGTAACCGTGGTCACAACCCGTGACGAGCAGGGCAGCCCAAGGGGCATGACGGCCAATTCGTTCACCTCCGTCTCTCTTGACCCGGCGTTGCTGCTGGTGTGCATTGGCAAGGGTGCAGCGAGCTATCCGGTGTTCCTGCAGGCCGACAGCTTTGCCGTCAACCTGCTGCACGAAGGGCAGGTCGCGCTTTCCAACGTCTTCGCCTCCAAAGCCCCCGACAAATTCGACCAGGTTAGCCACGTTGCGGTGCACACCGGGGCACCGGTGCTGACCGATTGCCTGACCTGGTTCGACTGCACGGTGCACCAGTGCATCGATGCTGGTGACCATATCATCCTGCTCGGTCAGGTCCAGGCGTTCGGTACCAGCCCCGAGGCGCCGTTGGGTTTCTGTCGCGGCCGCTATGCCCAGGTCAAGGACCCGCTGCCACCGGGCTGGCTCTCGGCGAGCGACATGATCACCGGCTACCTGATCGAATCCGAAGGGCGCTTGCTCCTGGCCGAGGATGGCAAGGGCGGCTGGGTGCTGCCGACCGCTTCGCGTCGACTCAAAGACGGCCGTCTGCCGCTGTCCGTGGGCGGCGAGTTGGCTCTGTTGCCCGATGACACCTTCCTCTATTCGGTGTTCGACACCGCCGATAACGACCCGGGTTATCTGATCTATCGCGCCAAACTGGCCGAAACGCTGGTGGAGGGCGCGCTGCCGCCGTCGCTGCGCTTCTTCGCCCTGGATCAGTTGCCCTACTCAGCCATCGCCTCCCACGAGATACGCGCCATGTTGCAACGCTATGCCCGTGAGACCGAGCGCGGCAGCTTTGGCATCTACATGGACTCCCAGGAGGGCGGGCGTGTCGCGATGGTCGGCAGCGCGCAGAGCTGGGACAAAGCCTACTGA序列表中序列2全长为972个核苷酸，包含一个长度为972个核苷酸的开放阅读框（ORF，自序列2的第1-972位核苷酸序列），编码一个长度为323个氨基酸（序列表中序列1）、分子量约为35KDa的蛋白，即为硫醚单加氧酶。含有所述单加氧酶编码基因的重组表达载体、含该重组表达载体的基因工程菌均属于本专利技术的保护范围。上述单加氧酶及其编码基因在制备手性亚砜类化合物中的应用也属于本专利技术的保护范围。经实验表明，本专利技术的假单胞菌硫醚单加氧酶PMO-6814，能催化2mM浓度的苯甲硫醚转化为R构型的苯甲亚砜，转化率为8.5%，对映选择性为59%。附图说明：图1为单加氧酶基因扩增示意图；M：DNA分子量标志。图2为单加氧酶基因表达载体酶切检测电泳图；M：DNA分子量标志；1-3为不同单克隆菌落重组质粒酶切检测电泳图谱。图3为单加氧酶蛋白在基因工程菌表达电泳图；1：含重组质粒的基因工程菌诱导前蛋白表达图谱；2：含重组质粒的基因工程菌诱导后蛋白表达图谱。箭头所示为目标蛋白条带。图4为含该单加氧酶蛋白的基因工程菌催化硫醚底物结果。具体实施方式我们从假单胞菌基因组中克隆了一个单加氧酶基因全长，构建表达载体导入了基因工程菌，并以基因工程菌为催化剂以硫醚为底物合成了手性亚砜。下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1.单加氧酶编码基因的获得分析假本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白质，是如下1)或2)所示的蛋白质：1）由序列表中的SEQ ID No.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2）将序列表中的SEQ ID No.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有硫醚单加氧酶功能的由SEQ ID No.1衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如序列表中的SEQIDNo.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质。2.权利要求1所述的蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如序列表中...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨加伟，陈永正，张红燕，崔宝东，韩文勇，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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