hCBS酶特异性抑制剂的结合靶标及其应用制造技术

本发明专利技术公开了hCBS酶特异性抑制剂的结合靶标及其在药物研发中的应用，构成所述靶标的氨基酸残基为：Lys119,Pro145,Thr146,Ser147,Gly148,Asn149,Thr150,Gly151,Met173,Lys177,Pro170,His202,Val204,Ser285,Thr299,Thr300,Tyr301,Val303,Gly304,Gly305,Ile306,Gly307,Tyr308,Asp309,Phe310。并用分子模拟法构建了hCBS酶蛋白与特异性抑制剂复合物的模型，确定了hCBS酶特异性抑制剂结合靶标的关键氨基酸残基。

【技术实现步骤摘要】
hCBS酶特异性抑制剂的结合靶标及其应用
本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种酶特异性抑制剂的结合靶标及其应用。
技术介绍
人体内源性的H2S气体分子参与并调控很多生理和病理过程，为重要的信号转导通路的调控分子。在结肠癌、神经退行性疾病、缺血性中风、低血压、高血压和胰腺炎等很多病理条件下，内源性H2S含量都发现有异常变化。因此，目前需要内源性H2S信号的特异抑制剂或激活剂作为分子探针工具去进一步阐述H2S的生理功能，和治疗与H2S-相关的疾病的小分子药物先导物。CBS(cystathionineβ-synthase,胱硫醚-β-合成酶)酶是一种PLP-依赖型(pyridoxal-5’-phosphate-dependent)酶，即维生素B6依赖型酶。在人体内，CBS酶催化底物L-半胱氨酸(Cysteine)和L-同型半胱氨酸（L-Homocysteine）产生内源性H2S气体。在循环休克、中风、唐氏综合症病人和癌症病人或模型动物的体内已发现过量的H2S和/或CBS活性的增强，因此，hCBS（humanCBS）酶和hCSE酶已经被认为是治疗循环休克、中风、唐氏综合症和肿瘤的潜在靶标。已知的hCBS酶小分子抑制剂，不仅与酶的结合力弱而且选择性也很低，因为他们对其它维生素B6-依赖型酶也有抑制作用。因此，急需筛选出特异性的hCBS酶抑制剂，可作为‘工具药’（astools）去证实已发现的H2S的生物学效应和信号通路作用，同时也可作为药物研发的先导化合物。目前，酶抑制剂的发现主要通过两种方法，即生物筛选和合理药物设计。基于靶点的合理药物设计就是通过对药物作用的靶点进行研究，找到新的、合适的药物来治疗某些疾病。发现一个的靶点往往就能设计出一类新药，在新药研究领域也是极受重视的。深入认识酶结构，特别是当它与特异性抑制剂复合时的结构，将会产生一种鉴定该酶中结合位点的方法，并获得酶/抑制剂复合物以及该酶中敏感残基的构象，这些知识对药物设计和优化方法来讲都是至关重要的。hCBS和hCSE的纯酶3D晶体结构已被报道，这为其靶向抑制剂的设计提供了一定的结构基础，但是与底物-结合相关的氨基酸残基还不清楚。因此，本领域的技术人员致力于研究hCBS的特异性抑制剂和其与hCBS的结合位点。
技术实现思路
本专利技术中所用缩写如下：hCBS指人源胱硫醚-β-合成酶，即humancystathionineβ-synthase；hDDC指人多巴脱羧酶，即humandopadecarboxylase；DTNB指5,5'-二硫代二（2-硝基苯甲酸），即5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoicacid)；Tris-HCl指三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，即Tris(hydroxymethyl)aminomethanehydrochloride；EDTA指乙二胺四乙酸，即EthyleneDiamineTetraaceticAcid；L-Cys指L-半胱氨酸，即L-Cysteine；D,L-HCys指D,L-同型半胱氨酸，即D,L-Homocysteine；SAM指S-腺苷甲硫氨酸，即S-adenosylmethionine；PLP指磷酸吡哆醛，即pyridoxal-5’-phosphate；7-氨基-2-羟基-5-亚氨基-6,7-二氢喹啉-8（5H）-酮，即7-amino-2-hydroxy-5-imino-6,7-dihydroquinolin-8(5H)-one；1,6–二甲基〔1,2,4〕三嗪并[5,4-e]-5,7（1H，6H）-嘧啶二酮，即1,6-dimethylpyrimido[5,4-e][1,2,4]triazine-5,7(1H,6H)-dione；2-氯-3-（4-甲基哌啶-1-基）萘-1,4-二酮，即2-chloro-3-(4-methylpiperidin-1-yl)naphthalene-1,4-dione；喹哪啶蓝，即quinaldineblue；HepG2细胞指人肝癌细胞系，即ahumanlivercarcinomacellline；本专利技术中所提到的酶促反应容器能够容纳H2S气体检测器，即气体检测容器能够置入酶促反应容器中，以使酶促反应产生的H2S气体能够全部扩散进入检测体系。本专利技术公开了一种hCBS酶特异性抑制剂的结合靶标，其所述hCBS酶的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；所述靶标的氨基酸残基为：Lys119,Pro145,Thr146,Ser147,Gly148,Asn149,Thr150,Gly151,Met173,Lys177,Pro170,His202,Val204,Ser285,Thr299,Thr300,Tyr301,Val303,Gly304,Gly305,Ile306,Gly307,Tyr308,Asp309,Phe310。本专利技术的另一个方面公开了所述结合靶标在开发特异性抑制hCBS酶促反应的药物中的应用，其中所述药物是指能够特异性抑制hCBS酶促反应产生H2S的小分子化合物。优选地，所述小分子化合物是指7-氨基-2-羟基-5-亚氨基-6,7-二氢喹啉-8(5H)-酮、1,6–二甲基[1,2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(1H,6H)-嘧啶二酮、喹哪啶蓝和2-氯-3-(4-甲基哌啶-1-基)萘-1,4-二酮。本专利技术中，用Compd.1指代7-氨基-2-羟基-5-亚氨基-6,7-二氢喹啉-8(5H)-酮；用Compd.2指代1,6–二甲基[1,2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(1H,6H)-嘧啶二酮；用Compd.3指代喹哪啶蓝；用Compd.4指代2-氯-3-(4-甲基哌啶-1-基)萘-1,4-二酮。Compd.1，Compd.2，Compd.3和Compd.4对hCBS以及hDDC酶促反应的IC50如表1所示，由表1可以看出，这四个化合物在hCBS和hDDC之间具有大于8倍的选择性。由于测定hDDC活性时，酶反应液中含有其它两种偶联酶，即苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶，因此这预示这些抑制剂也不影响其他两种酶的活性，这四个化合物是是hCBS酶促反应的特异性抑制剂。另一方面，本专利技术公开了一种检测小分子化合物对hCBS酶促反应抑制活性的方法，包括如下步骤：步骤一、配制缓冲溶液：在酶促反应容器中配置Tris-HCl浓度为50mM，PLP浓度为100μM，hCBS-413浓度为50-500nM，L-Cys浓度为4mM，D,L-HCys浓度为4mM的去离子水溶液，其pH为8.4-9.0；步骤二、配制酶促反应混合液：将小分子化合物加入到步骤一所配制的缓冲溶液中，配制成酶促反应混合液，形成酶促反应体系；步骤三、配制H2S气体检测体系：在H2S气体检测容器中，加入50μL的DTNB溶液，所述DTNB溶液为：DTNB浓度为300μM，Tris-HCl浓度为262mM，EDTA浓度为13mM，pH=8.9的去离子水溶液，形成H2S气体检测体系；本专利技术中所提到的酶促反应容器能够容纳H2S气体检测容器，即气体检测容器能够置入酶促反应容器中，以使酶促反应产生的H2S气体能够扩散进入检测体系；步骤四、孵育过程：用封板膜密封所述酶促反应容器，在37℃下孵育60分钟；步骤五、待测化合物作为hCBS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种hCBS酶特异性抑制剂的结合靶标，其特征在于，构成所述靶标的氨基酸残基为：Lys119,Pro145,Thr146,Ser147,Gly148,Asn149,Thr150,Gly151,Met173,Lys177,Pro170,His202,Val204,Ser285,Thr299,Thr300,Tyr301,Val303,Gly304,Gly305,Ile306,Gly307,Tyr308,Asp309,Phe310。

【技术特征摘要】
1.一种小分子化合物在体外作为hCBS酶特异性抑制剂的应用，其特征在于，所述hCBS酶的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；构成所述hCBS酶特异性抑制剂的结合靶标的氨基酸残基为：Lys119,Pro145,Thr146,Ser147,Gly148,Asn149,Thr150,Gly151,Met173,Lys177,Pro170,His202,Val204,Ser285,Th...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷希岭，吴方，周越洋，于晶，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31