突变的核酸和表达载体以及酵母菌株及其制备方法与用途技术

突变的核酸和表达载体以及酵母菌株及其制备方法与用途。本发明专利技术公开了一种序列如SEQ ID NO:1所示的突变的核酸，或者，序列由5’端连接有Kozak序列的SEQ ID NO:1组成的突变的核酸；插入有该核酸的表达载体和利用该表达载体制备高抗逆性酵母菌株的方法；高抗逆性酵母菌株；制备高抗逆性酵母菌株的方法以及高抗逆性酵母菌株在生产乙醇中的用途。通过上述技术方案，利用本发明专利技术突变的核酸构建的表达载体转化酵母后，能够获得具有高抗逆性和多重胁迫耐受性的酵母菌株，该酵母菌株的遗传性能稳定，在乙醇生产中的糖利用率和乙醇产量均较高，可应用于目前的燃料乙醇生产工艺和木质纤维素乙醇新工艺中，实用性较强。

【技术实现步骤摘要】
突变的核酸和表达载体以及酵母菌株及其制备方法与用途
本专利技术涉及一种突变的核酸与表达载体和制备高抗逆性酵母菌株的方法以及酵母菌株及其制备方法与用途，具体地，涉及一种突变的核酸、插入有该核酸的表达载体、利用该表达载体制备高抗逆性酵母菌株的方法、高抗逆性酵母菌株、制备高抗逆性酵母菌株的方法以及高抗逆性酵母菌株在生产乙醇中的用途。
技术介绍
由于传统化石能源用量急增，能源紧缺已成为世界性问题，能源多元化发展和加快可再生能源开发已成为世界各国的研发重点，其中，燃料乙醇的生产和应用在经济发展和战略安全上显示出重大意义。以燃料乙醇等替代能源为代表的能源供应多元化战略已成为我国能源政策的重要方向。木质纤维素是十分丰富而廉价的生物质原料，可以被降解为可发酵性糖，用于燃料乙醇的生产。大力发展生物质燃料乙醇作为可再生能源，有助于缓解石油资源短缺，改善大气环境等问题，在稳定粮食生产、促进农业生产与消费的良性循环和可持续发展等方面具有积极作用。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为单细胞真核生物，具有易培养、生长周期短的特点，已广泛应用于异源基因的表达。虽然普通酿酒酵母能够高效利用葡萄糖产乙醇，但对发酵液中的抑制物和高浓乙醇耐受性(AlmeidaJRMetal.,2007)较差，特别是对纤维素水解液中的抑制成分敏感，使酿酒酵母无法成为木质纤维素乙醇生产的优势菌株；其次，纤维素乙醇生产中，纤维素原料预处理过程产生和残留的降解物会对后续菌株发酵造成不同程度的抑制，其中，乙酸、糠醛、酚类和SO42-等抑制因子对酵母有较强毒害作用，会显著抑制细胞的生长及其发酵性能。目前，在纤维素乙醇生产菌种——酿酒酵母的研究领域，大多集中于将各种实验室缺陷型菌种为研究对象进行改造，而缺乏能够应用于生产的野生型酵母模型，能够耐受多重抑制物、具有高抗逆性的酿酒酵母具有更强的实用性，显然，研究获得具有上述特性的酵母模型极为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够使酵母菌株稳定发酵产乙醇、耐受多重抑制物而具有高抗逆性的突变的核酸、插入有该核酸的表达载体和利用该表达载体制备高抗逆性酵母菌株的方法、高抗逆性酵母菌株、制备高抗逆性酵母菌株的方法以及高抗逆性酵母菌株在生产乙醇中的用途。为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种突变的核酸，其中，该突变的核酸的序列如SEQIDNO:1所示，或者，该突变的核酸的序列由5’端连接有Kozak序列的SEQIDNO:1组成。第二方面，本专利技术提供了一种表达载体，其中，该表达载体插入有上述本专利技术的突变的核酸。第三方面，本专利技术提供了一种制备高抗逆性酵母菌株的方法，其中，该方法包括：使用上述本专利技术的表达载体转化酵母细胞，得到转化后的酵母细胞。第四方面，本专利技术提供了一种酵母菌株，该酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌株，所述酵母菌株的保藏号为CGMCCNo.8203。第五方面，本专利技术提供了第四方面的酵母菌株在生产乙醇中的用途。第六方面，本专利技术提供了一种生产乙醇的方法，该方法包括：用第四方面的酵母菌株对乙醇发酵原液进行乙醇发酵。通过上述技术方案，利用本专利技术突变的核酸构建的表达载体转化酵母后，能够获得具有高抗逆性和多重胁迫耐受性的酵母菌株，该酵母菌株的遗传性能稳定，在乙醇生产中的糖利用率和乙醇产量均较高，可应用于目前的燃料乙醇生产工艺和木质纤维素乙醇新工艺中，实用性较强。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。生物保藏本专利技术的酵母菌株——酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)于2013年9月24日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(缩写为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNo.8203。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。在本专利技术中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“抗逆性”是指微生物在偏离其最佳生长条件下的环境中的生长和发酵能力，比如较高或较低的温度，较高或较低的pH，较高或较低的渗透压，较高的反馈抑制，有毒物质的存在等环境。本专利技术提供了一种突变的核酸，该突变的核酸的序列如SEQIDNO:1所示，或者，该突变的核酸的序列由5’端连接有Kozak序列的SEQIDNO:1组成。atgtccggaaaagcctctacagagggtagcgttactacggagtttctctctgatatcattggtaagacagtgaacgtcaaacttgcctcgggtttactctacagcggaagattggaatccattgatggttttatgaatgttgcactatcgagtgccactgaacactacgagagtaataacaataagcttctaaataagttcaatagtgatgtctttttgaggggcacgcaggtcatgtatatcagtgaacaaaaaatatag(SEQIDNO:1)在本专利技术的优选实施方式中，所述突变的核酸的序列由5’端连接有Kozak序列的SEQIDNO:1组成。其中，Kozak序列是指用来增强真核基因翻译效率，避免核糖体出现漏洞扫描(leakyscan)的序列。各种常规的Kozak序列都可以用于本专利技术。进一步优选地，所述突变的核酸的序列如SEQIDNO:2所示。gccaccatgtccggaaaagcctctacagagggtagcgttactacggagtttctctctgatatcattggtaagacagtgaacgtcaaacttgcctcgggtttactctacagcggaagattggaatccattgatggttttatgaatgttgcactatcgagtgccactgaacactacgagagtaataacaataagcttctaaataagttcaatagtgatgtctttttgaggggcacgcaggtcatgtatatcagtgaacaaaaaatatag(SEQIDNO:2)本专利技术还提供了一种表达载体，该表达载体插入有序列如上所述的突变的核酸。其中，所述表达载体可以为插入有本专利技术的突变的核酸并能够使突变的核酸表达的任何表达载体，例如，质粒或噬菌体。根据本专利技术，所述表达载体中的启动子可以为组成型启动子或诱导型启动子。为了进一步增强表达效率，优选地，所述表达载体中的启动子为Padh1启动子、Ppgk启动子或Pfbp启动子。更优选地，所述表达载体中的启动子为Padh1启动子。根据本专利技术，对所述表达载体中的终止子没有特别的限定，且本领域技术人员能够很容易地选择适当的终止子来构建能够表达本专利技术突变的核酸的表达载体。根据本专利技术的一种优选实施方式，所述表达载体为在质粒pAUR123的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间插入序列如上所述的突变的核酸而得到的表达载体。将本专利技术优选实施方式中的表达载体转化到酿酒酵母细胞中时能够获得更高的表达效率，从而能够更好地实现本专利技术的目的。此外，本专利技术还提供了一种制备高抗逆性酵母菌株的方法，该方法包括：使本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变的核酸，其特征在于，该突变的核酸的序列如SEQ ID NO:1所示，或者，该突变的核酸的序列由5’端连接有Kozak序列的SEQ ID NO:1组成。

【技术特征摘要】
2013.10.29 CN 2013105222070;2013.10.29 CN 201310521.一种突变的核酸，其特征在于，该突变的核酸的序列如SEQIDNO:1所示，或者，该突变的核酸的序列由连接在5’端的Kozak序列和SEQIDNO:1组成。2.根据权利要求1所述的突变的核酸，其中，所述突变的核酸的序列如SEQIDNO:2所示。3.一种表达载体，其特征在于，该表达载体插入有权利要求1或2所述的突变的核酸。4.根据权利要求3所述的表达载体，其中，所述表达载体中的启动子为组成型启动子或诱导型启动子。5.根据权利要求4所述的表达载体，其中，所述表达载体中的启动子为Padh1启动子、Ppgk启动子或Pfbp启动子。6.根据权利要求3所述的表达载体，其中，所述表达载体为在质粒pAUR123的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间插入权利要求1或2所述的突变的核酸而得到的表达载体。7.一种制备高抗逆性酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：高岚，刘颖，郭勇，刘金胜，李宝石，蔺建民，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中国石油化工股份有限公司石油化工科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11