人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD制造技术

人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD，属于遗传工程技术领域，其特征在于GsDREB2基因内部存在着具有抑制GsDREB2转录激活功能和与DRE元件结合功能的负向调节结构域NRD；人工改造GsDREB2基因，使NRD结构域缺失，改造后基因命名为GsDREB2-mNRD，其碱基组成Seq ID No:3所示。GsDREB2-mNRD基因超量表达拟南芥的耐盐和干旱能力较GsDREB2基因超量表达拟南芥高。

【技术实现步骤摘要】
人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD
本专利技术涉及一种人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD，属于遗传工程

技术介绍
DREBs/CBF（DehydrationResponsiveElementBindingprotein,脱水应答元件结合蛋白；CBF-repeatbindingfactor,C-repeat元件结合因子）类转录因子与DRE/C-repeat元件在胁迫基因表达方面为我们呈现了一个重要的转录调控系统。分析表明，这些转录因子基因的表达与不同的生理条件相关。例如，DREB1A、B、C/CBF1、2、3被低温诱导，DREB1A、DREB1D/CBF4、DREB2A和DREB2B被盐和干旱诱导，DREB1F被盐诱导，而DREB1E受ABA（abscisicacid，脱落酸）诱导。拟南芥中一些胁迫诱导基因如rd29A、Cor6.6、Corl5a和Kinl等都被DREBs/CBFs诱导表达，它们的启动子中均含有DRE/C-repeat元件。Seki等人鉴定出6个新基因，它们的启动子中同时含有DRE/C-repeat和ABRE元件，意味着这些基因可能既存在于胁迫反应的ABA依赖途径中，又存在于ABA不依赖途径中。Liu等从干旱处理的拟南芥cDNA文库中克隆到2个与DRE元件结合，在干旱、高盐胁迫下调控报道基因GUS（β-glucuronidase，β-葡萄糖苷酸酶）表达的基因，定名为DREB2A和DREB2B。它们受干旱和高盐诱导表达，为干旱和高盐应答基因，如用干旱或高盐(250mmol/LNaCl)进行胁迫处理，15min内，DREB2A和DREB2B基因即可被快速强烈诱导表达，尤其在植物根部，但是，这两个基因不受外源ABA的诱导。在DREB转基因植物中，DREB转录因子基因的过量表达可以激活靶基因的表达，提高植物对低温、干旱等逆境的忍耐力。Liu等研究转入35S∶DREB1Ab和35S∶DREB1Ac的转基因拟南芥，将植株在-6℃处理2天，再恢复正常温度生长，结果对照野生型植株全部死亡，而转入35S∶DREB1Ab和35S∶DREB1Ac的植株的存活力分别为19%和17%。检测对干旱的忍耐力时，对植株作2周不浇水处理，结果对照野生型植株全部死亡，而转入35S∶DREB1Ab和35S∶DREB1Ac的植株再恢复浇水后分别有19%和14%的存活。Dubouzet等和Qin等分别将克隆的水稻OsDREB1AcDNA，玉米ZmDREB1AcDNA转入拟南芥，结果转基因拟南芥对低温、干旱和高盐的忍耐力大大高于野生型拟南芥。2005年，陈受益等在大豆中分离到了3个DREB基因，分别为GmDREBa、GmDREBb、GmDREBc，并推断该3个基因均能应答非生物胁迫。王巧燕等从大豆耐盐品种中克隆了一个新的DREB基因GmDREB2。并通过拟南芥、烟草验证基因的功能。在后续的研究中发现，该基因提高了转基因拟南芥对干旱和高盐的抗性，并且，过量表达该基因的转基因烟草，在干旱条件下，自由脯氨酸的含量较对照明显提高。该研究表明，该基因在转录激活中起到重要的作用，并能够促进植物对非生物胁迫的抗性，可以应用于非生物胁迫基因工程中，有效地提高作物的耐逆性。2008年，马有志等又分离到大豆GmDREB3基因，在研究中还发现，该基因在组成型启动子的调控下，转基因植株的生长受到抑制，而使用Rd29A启动子则不影响转基因植株的生长。DREB转录因子的研究已较为深入，但是对该转录因子上游的调控机理并不十分清楚，对该转录因子激活、结合及其它结构的功能也还有欠缺。在研究中发现，拟南芥DREB2A转录因子的内部存在一个负向调节结构域（negativeregulatorydomain,NRD），该结构域的存在影响着DREB2A转录因子的结合和激活功能，并且研究发现，该结构域的缺失可以提高植物对干旱的耐受性（SakumaY,MaruyamaK,OsakabeY,QinF,SekiM,ShinozakiK,Yamaguchi-ShinozakiK.FunctionalanalysisofanArabidopsistranscriptionfactor,DREB2A,involvedindrought-responsivegeneexpression.PlantCell,2006,18(5):1292-309）。本研究室克隆了野生大豆的GsDREB2基因（野生大豆DREB基因的筛选与结合功能分析，哈尔滨工业大学学报，2009，41(9):198-200；野生大豆DREB基因cDNA的克隆与分析,草业科学，2009，26(8):17-23），并深入的研究了该基因的功能。但是在进行超量表达GsDREB基因拟南芥和烟草的耐盐和干旱胁迫试验时发现，该基因并没有明显的使转基因拟南芥或烟草的耐逆性提高，鉴于以上的研究，提出这样的疑问，GsDREB2基因内部是否也存在着负向调节结构域，该结构域的存在是否也影响着GsDREB2基因的调节功能呢？通过实验我们发现来源于野生大豆的GsDREB2基因内部含有NRD，该结构域具有抑制DREB转录因子与DRE元件结合的特性，同样也抑制转录激活功能。如何改造GsDREB2基因并将人工改造的GsDREB2-mNRD基因转化拟南芥，用于提高拟南芥的耐盐性和抗旱性成为急需解决的一大难题。所以，专利技术一种人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD（m：mutant）是必要的。
技术实现思路
为了克服如何改造GsDREB2基因并将人工改造的GsDREB2-mNRD基因转化拟南芥，用于提高拟南芥的耐盐性和抗旱性的难题，本专利技术提供了一种人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD，该人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD利用对GsDREB2基因进行改造，使NRD结构域缺失，将人工改造的GsDREB2-mNRD基因转化拟南芥，可以达到提高拟南芥的耐盐性和抗旱性目的。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：本专利技术的人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD，其特征在于GsDREB2基因内部存在着具有抑制GsDREB2转录激活功能和与DRE元件结合功能的负向调节结构域NRD；人工改造GsDREB2基因，使NRD结构域缺失，改造后基因命名为GsDREB2-mNRD（SeqIDNo:3）。所述的NRD结构域的预测是用拟南芥AtDREB2A基因（At5g05410）与GsDREB2基因的氨基酸序列进行序列比对，确定GsDREB2基因的结构域区域，选择AP2结构域（即转录因子与DNA结合的结构区区域）和转录激活区域之间的丝氨酸(Ser)苏氨酸(Thr)富集区域（GsDREB2全长基因140-204aa）做为预测的NRD区域。根据预测的NRD位点，设计不同缺失片段扩增的引物序列，并添加相应的酶切位点，以便于构建转录激活和转录结合的载体pGBKT7与pGADT7-Rec2。所述的不同缺失片段于DRE元件结合能力的分析，首先构建4merDRE报告载体：以CCGAC为核心序列（DRE元件的核心序列），进行4本文档来自技高网...

【技术保护点】
人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2‑mNRD，其特征在于GsDREB2基因内部存在着具有抑制GsDREB2转录激活功能和与DRE元件结合功能的负向调节结构域NRD；人工改造GsDREB2基因，使NRD结构域缺失，改造后基因命名为GsDREB2‑mNRD（Seq ID No:3）。

【技术特征摘要】
1.人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD，其特征在于GsDREB2基因内部存在着具有抑制GsDREB2转录激活功能和与DRE...

【专利技术属性】
技术研发人员：才华，冯明芳，柏锡，崔国文，纪巍，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23