一种抗A/B亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及动物病毒学和免疫学领域，提供了一种抗A/B亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗，该疫苗采用原核表达后筛选纯化的高活性的重组蛋白His-cENV联合弗氏佐剂制备而得，其中编码重组蛋白His-cENV的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，利用该表位疫苗免疫7日龄种禽雏鸡可以产生1:128000的中和抗体，体外病毒中和实验、动物实验显示该表位疫苗可中和不同ALV-A/B分离毒株，有效保护鸡群抵抗ALV-A/B毒株感染，该表位疫苗基于env来源的多表位抗原基因序列，克服了ALV-A/B的病毒变异，开辟了ALV-A/B疫苗新时代，提供了抗ALV-A/B感染的新手段，为ALV-A/B的防控提供了技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种抗A/B亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗及其制备方法和应用
本专利技术涉及免疫学领域，具体提供了一种抗A/B亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
禽白血病是指由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽反转录病毒引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的各种可传染的肿瘤性疾病。以禽淋巴细胞白血病和髓细胞白血病较为常见，通过垂直传播和水平传播两种方式在世界各国鸡群中广泛流行，引起鸡死亡、消瘦、生长发育不良，同时引起机体抵抗力下降和免疫抑制，是危害养禽业的主要疾病之一。依据病毒囊膜糖蛋白的抗原差异、病毒干扰实验、宿主范围和基因组的分子生物学特性，感染鸡群的禽白血病病毒群主要分为A、B、C、D、E、J六个亚群，其中A、B亚群毒株基因序列具有很高的同源性，具有相近的病毒特性。我国A/B亚群禽白血病的发生已相当普遍，临床病例从最初的商品肉鸡群发展到商品蛋鸡、地方种鸡群及其他家禽，并伴随着致瘤性增强及肿瘤多样性的发生。研究显示，我国的A/B亚群禽白血病毒呈现高感染率、高发病率，早期感染普遍、发病日龄明显提前，混合感染多发/频发，宿主范围扩展、肿瘤谱扩大，病理变化复杂化等特点，给我国的养禽业造成了巨大的损失。基于病毒囊膜蛋白的超变特性，加之自身的免疫逃避能力及宿主的免疫选择压力，使得禽白血病病毒的抗原变动性极大，成为其传统灭活疫苗、弱毒疫苗研制无法逾越的瓶颈。目前，临床上尚无相关药物及疫苗用于A/B亚群禽白血病的防控。国外通过净化控制本病的发生，由于净化周期长、成本高，在我国目前还未能有效实施，只能通过淘汰感染鸡只进行大群净化，无法控制ALV-A/B的感染，不断出现ALV-A/B大范围密集感染的报道，我国的A/B亚群禽白血病防控形势严峻。国内外均有过对于A/B亚群禽白血病的疫苗研发方法的报道，主要为传统的甲醛灭活疫苗、弱毒疫苗，基于SU的亚单位疫苗、核酸疫苗，这些疫苗在一定程度上可以对机体提供保护，但都会造成毒力恢复以及散毒的可能，免疫效果不稳定无法临床应用。基于以上现状，研制安全高效的表位疫苗对于A/B亚群禽白血病病毒的防控具有重大现实意义。表位疫苗是近年发展起来成熟的新型疫苗，在人源病毒中研究深入。表位疫苗是利用基因工程手段，体外表达或人工合成病原微生物的表位，继而开发出预防性或治疗性疫苗。表位疫苗相对传统疫苗拥有较多优势，表位肽短小，免疫原性强，可以克服主要组织相容性复合体(MHC)分子的遗传限制，本身安全、无毒、稳定，可以直接刺激机体产生特异性免疫反应，其最大的优点就是可以克服传统疫苗造成的毒力恢复或散毒的可能，有着非常广阔的发展前景。目前，已开发出有效的艾滋病病毒、乙肝病毒、人类疱疹病毒等表位疫苗。ALV-A/B属于反转录病毒。病毒囊膜蛋白(env)可分为由gp85基因编码的表面蛋白(surfaceprotein,SU)和gp37基因编码的跨膜蛋白(transmembraneprotein，TM)，二者在一起形成二聚体，病毒囊膜蛋白决定亚群的特异性。gp85是病毒囊膜蛋白表面的主要成分，在ALV感染吸附宿主细胞并诱导机体产生特异性抗体中具有重要作用，含有众多的抗原表位，负责识别靶细胞膜上的特异性受体，TM主要负责介导病毒与细胞的融合过程。基于ALV-A/B的病毒特性，表位疫苗的研究成果为对抗ALV-A/B的超变特性，成功研制ALV-A/B疫苗提供了科学基础和技术支撑。
技术实现思路
针对现有技术中的相关情况，专利技术人考虑将表位疫苗应用于抗禽A/B亚群禽白血病病毒感染疫苗，进而经研究实验后提供了一种抗A/B亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗，该疫苗采用原核表达后筛选纯化的高活性的重组蛋白His-cENV联合弗氏佐剂制备而得，其中编码重组蛋白His-cENV的核苷酸序列，如SEQIDNO.1所示，利用该表位疫苗免疫7日龄种禽雏鸡可以产生1:128000的中和抗体，体外病毒中和实验、动物实验显示该表位疫苗可中和不同ALV-A/B分离毒株，有效保护鸡群抵抗ALV-A/B毒株感染，该表位疫苗基于env来源的多表位抗原基因序列，克服了ALV-A/B的病毒变异，开辟了ALV-A/B疫苗新时代，提供了抗ALV-A/B感染的新手段，为ALV-A/B的防控提供了技术支撑。专利技术人经研究发现ALV-J在整个env都存在不同的抗原表位，通过筛选env上的抗原表位可以开发有效的多表位疫苗。通过专利技术人前期对ALV-A/B的致病性进行了系统深入的研究，在系统解析其免疫抑制机制、跨种传播机制和免疫逃避机制的基础上，结合多表位可以传递广谱表位信息这一理念，最终制备了抗禽A/B亚群禽白血病病毒感染疫苗，可以避免由于病毒变异而造成的免疫失败，有利于提供更完全和更有针对性的免疫保护，表位疫苗的研究成果为的研制开辟了新的方向和重要的技术支撑。本专利技术的具体技术方案如下：通过分析获得NCBI上发表的ALV-A/B囊膜上的抗原表位，筛选出代表流行毒株的抗原表位基因序列，通过采用编码甘氨酸、丝氨酸的密码子进行串联，最终确定人工合成基因片段1148bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，原核表达出重组蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，联合弗氏佐剂制备表位疫苗，所获得的表位疫苗可以实现保护机体抵抗A/B亚群禽白血病感染。其具体过程如下：查找NCBI上发表的ALV-A/B囊膜基因序列，结合国内外对ALV-A/B抗原表位及免疫逃避机制的研究进展，运用DNAman软件分析获得来源于囊膜基因的22段抗原表位，筛选出代表流行毒株囊膜抗原表位基因序列，采用编码甘氨酸、丝氨酸的密码子进行串联，获得重组囊膜基因序列1148bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述基因序列5’端含NcoⅠ酶切位点，3’端含XhoⅠ酶切位点。上述基因序列由上海生工生物工程有限公司合成，合成产物cENV连接至pUC57载体。合成产物测序，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；将该基因片段连接至pET30a载体，得到了重组载体pET30a-cENV，使用1-1.5mmol/LIPTG诱导表达得到带有HIS标签的重组蛋白His-cENV，进而利用该蛋白联合弗氏佐剂制备表位疫苗。本专利技术的这种表位疫苗安全高效，成本低易于大规模批量生产，可抵抗45％ALV-A/B毒株的感染，二免后抗体维持时间达到11周，可以实现对种鸡开产前的保护，从而切断病毒的垂直传播途径，对于我国A/B亚群禽白血病的防控净化具有重要意义，且特异性强可以实现对禽A/B亚群禽白血病的保护；同时由于其含有广谱的表位信息，可以避免由于病毒变异而造成的免疫失败，为A/B亚群禽白血病的防治提供更完全和更有针对性、更为高效安全的疫苗保护。附图说明图1为重组质粒双酶切鉴定结果电泳图，图中M为DL10000Marker，1为使用限制性内切酶NcoI、XhoI双酶切pUC57-cENV后获得的基因片段；图2为重组表达菌表达结果及蛋白纯化前后SDS-PAGE分析结果，图中M为170KDProteinLadder；1为诱导表达菌液沉淀，2为上清，3为大量表达蛋白沉淀，4为大量表达蛋白纯化后结果；图3为WesternBlot法检测重组蛋白，图中A为使用His标签抗体，B为IDEXX检测试剂盒检测为阳性的鸡血清，验证结果。具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗A/B亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗，其特征在于：该疫苗采用原核表达后筛选纯化的高活性的重组蛋白His‑cENV联合弗氏佐剂制备而得，其中编码重组蛋白His‑cENV的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，原核表达出重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗A/B亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗，其特征在于：该疫苗采用原核表达后筛选纯化的高活性的重组蛋白His-cENV联合弗氏佐剂制备而得，其中编码重组蛋白His-cE...

【专利技术属性】
技术研发人员：成子强，侯敏博，杨治聪，马晓倩，王永波，孟薇，李根，庄萍萍，冯卫国，王桂花，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37