一种海绵动物水溶性肽类的制备方法技术

一种海绵动物水溶性肽类的制备方法，涉及一种肽类制备方法。将海绵动物破碎，用提取缓冲液浸泡，超声，离心后获得可溶解蛋白/肽类水溶液，过滤后进行吸附/解吸附，获得脱盐后的肽类第一级粗提物；将肽类第一级粗提物经旋转蒸发浓缩后进行第二级纯化，获得10～30个第二级组分，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存，第二级纯化的具体方法是采用乙腈-水梯度反相HPLC方法，获得10～30个第二级组分；将第二级组分中主成分小于95％的二级组分经旋转蒸发浓缩后进行第三级纯化，获得海绵动物水溶性肽类，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存。可增加肽的种类、提高处理规模和分离效率，以便利海绵活性肽类药物开发。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种肽类制备方法，尤其是涉及一种海绵动物水溶性肽类的制备方 法。
技术介绍
人们已经从海洋生物中分离出20, 000余种天然产物，包括肽类、蛋白质类、多糖 类、生物碱类、萜类、大环聚酯类等，其中数量庞大的一类化合物是肽类，相较于大蛋白，肽 类的分子量小、无免疫原性、结构简单、副作用小、生物活性高。又由于海洋生物生存的特定 环境，海洋肽类的结构与陆生动植物肽有很大不同，海洋肽类的开发日益成为海洋药物研 宄的热点。 海绵属于多孔动物门，是动物中最低等的多细胞无脊椎动物，也是最具开发潜 力的药源海洋生物。在目前发现的海洋天然产物中，有7, 000多种来自海绵，并以每年 200余种新化合物的发现速度递增。其中的新型肽类不仅占了较高比例，某些还极具药 用开发潜力。比如海绵来源的一种三肽化合物Hemiasterlin是微管蛋白的解聚物，能 诱导有丝分裂阻滞和细胞凋亡，具有良好的开发为抗癌药物的潜力（Bai，R.，Durso,N. A.,Sackett,D.L.andHamel,E. (1999)Interactionsofthesponge-derived antimitotictripeptidehemiasterlinwithtubulin:comparisonwithdolastatin IOandcryptophycinI.Biochemistry，38, 14302-1431)。从蒂壳海绵属Theonella sp.中分离得到双环肽类TheonellamideA-F，它们有强烈的抗真菌活性（Wada，S.，Mat sunaga,S. ,Fusetani,N.andWatabe,S. (1999)TheonellamideF，aBicyclicPeptide MarineToxin,InducesFormationofVacuolesin3YlRatEmbryonicFibroblast. MarBiotechnol(NY)，1，337-341 ;3.Wada，S.，Matsunaga，S.，Fusetani，N.andWatabe，S. (2000)InteractionofCytotoxicBicyclicPeptides，TheonellamidesAand F,withGlutamateDehydrogenaseandl7beta-HydroxysteroidDehydrogenaseIV.Mar Biotechnol(NY), 2, 285-292)。这些例子表明海绵肽类的开发前景良好。但是已发现的海 绵肽类主要是通过有机萃取获得的，肽类通常与其他类别的化合物混杂在一起，目前还没 有一个系统富集和分离海绵肽类的方法，肽的种类、分离效率和规模受到极大限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供可增加肽的种类、提高处理规模和分离效率，以便利海绵活 性肽类药物开发的。 本专利技术包括以下步骤： 1)将海绵动物破碎，用提取缓冲液浸泡，超声，离心后获得可溶解蛋白/肽类水溶 液，过滤后进行吸附/解吸附，获得脱盐后的肽类第一级粗提物； 2)将肽类第一级粗提物经旋转蒸发浓缩后进行第二级纯化得10?30个第二级组 分，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存； 3)将第二级组分中主成分小于95%的二级组分经旋转蒸发浓缩后进行第三级纯 化得海绵动物水溶性肽类，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存。 在步骤1)中，所述破碎可采用冷冻破碎或冻干后破碎；所述冷冻破碎可在液氮温 度下用粉碎机破碎海绵动物组织块；所述冻干后破碎可将海绵冻干后用粉碎机破碎； 所述提取缓冲液的配方可为：水，10%乙醇，20禮1^8-11(：1?117.5,51111￡0丁八， 0.5 %TritonX-100或NP-40,临用时加lmM0-巯基乙醇、20yM苯硫脲、ImMPMSF和 10yg/mL抑肽酶，每隔Ih加一次PMSF; 所述浸泡可于4°c层析柜中以2?4倍海绵动物质量的提取缓冲液浸泡，浸泡时 间为1?2h;所述离心可于8000Xg离心30min;所述过滤可采用切向流过滤，所述切向流 过滤可采用PALLCentramate超滤系统，先用MWC0300K膜包滤去大分子蛋白，滤过液再用 MWC05K或MWCOlK膜包滤过小分子蛋白/肽类，需要注意的是膜包标称的滤过或截留孔径大 小要经过实验验证，标称IOK的膜包在实际中会滤过部分10?20K的蛋白； 所述吸附/解吸附流程可采用大孔吸附树脂吸附，将处理好的大孔吸附树脂与切 向流滤过液混合，4°C下，通过摇床、磁力搅拌、机械搅拌等方式连续搅拌10?14h，之后用 去离子水漂洗大孔吸附树脂至少5次，再将大孔吸附树脂装入层析柱用层析系统在280nm 或215nm波长检测肽类洗脱过程，洗脱中逐步提高乙醇浓度到75%，最后用50mMNaOH洗 脱，最大量的组分在60%?75%乙醇区间洗脱，收集10%?50乙醇洗脱组分和50mMNaOH 洗脱组分；所述大孔吸附树脂与切向流滤过液的体积比可为1 : (3?20);所述大孔吸附 树脂可采用型号为DA201-C、NKA-9、AB-8或DlOl等大孔吸附树脂中的一种，优选型号为 DA201-C大孔吸附树脂。 在步骤2)中，所述第二级纯化的具体方法是采用乙腈-水梯度反相HPLC方法，乙 腈-水梯度反相HPLC方法采用C18反相柱WelchUltimataXB-C18,内径30mm，高度250mm， 填料粒径l〇ym，孔径300A，或同类型产品；所用的流动相含〇. 1%三氟乙酸；上样样品用 起始乙腈浓度含0. 1 %三氟乙酸的水溶液溶解；第二级纯化的HPLC每次上样3. 5mL，梯度程 序为：0 ?40min，3%- 70% 乙腈；40 ?43min，70%- 100% 乙腈；43 ?53min，100% 乙腈， 流速27mL/min，检测波长280nm或215nm。 在步骤3)中，所述第三级纯化的具体方法可采用乙腈-水梯度反相HPLC方法，乙 腈-水梯度反相HPLC方法采用C18反相柱WelchUltimataXB-C18,内径30mm，高度250mm， 填料粒径l〇ym，孔径300A,或同类型产品；所用的流动相含〇.I%三氟乙酸；上样样品用 起始乙腈浓度含0. 1 %三氟乙酸的水溶液溶解；第三级纯化的HPLC每次上样0. 5?I.OmL， 以二级组分收集点的乙腈浓度减3%的乙腈-水溶液等度洗脱40min;40 - 45min，乙腈浓 度升到 100% ;45 - 55min，100% 乙腈，流速 13. 5mL/min，检测波长 280nm或 215nm。 本专利技术的优点在于： 1.高效而廉价。水溶性肽类提取的难点在于脱盐，许多寡肽的分子量小于1000， 很难与水溶液中的盐类分开。脱盐可采取凝胶过滤、固相萃取或纳滤方法。凝胶过滤填料 贵，上样量少，每次耗时长。以价格1万元的凝胶过滤柱处理Ikg湿重海绵溶出的水溶性肽 合计用时15天以上，并随处理量的增加而等比例增加，这么长的处理时间在效率上、在肽 类的活性保留上是非常不利的。另一类脱盐方法是C18或C8固相萃取，但这类固相萃取填 料与水溶液不亲和，水系溶液不易通过，升以上的操作很难开本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海绵动物水溶性肽类的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)将海绵动物破碎，用提取缓冲液浸泡，超声，离心后获得可溶解蛋白/肽类水溶液，过滤后进行吸附/解吸附，获得脱盐后的肽类第一级粗提物；2)将肽类第一级粗提物经旋转蒸发浓缩后进行第二级纯化得10～30个第二级组分，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存；3)将第二级组分中主成分小于95％的二级组分经旋转蒸发浓缩后进行第三级纯化得海绵动物水溶性肽类，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈军，丁少雄，王德祥，贺腾飞，罗联忠，赵晶，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35