靶向T淋巴细胞的人源单链抗体制造技术

本发明专利技术涉及基因工程和蛋白质工程技术领域。具体涉及编码包含人源CD3抗体可变区片段的重组融合蛋白的DNA、其所编码的融合蛋白、该融合蛋白的生产方法、该融合蛋白的应用。本发明专利技术提供了包含人源CD3单链抗体的蛋白，其能够结合CD3阳性的T淋巴细胞，不结合CD3阴性细胞，显示出特异的靶向结合活性，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程
，具体地说，涉及编码包含人源⑶3 抗体可变区片段的DNA、其所编码的重组蛋白、该重组蛋白的生产方法、该重组蛋白的用途。 专利技术背景T淋巴细胞是一种在人体内广泛分布的免疫效应细胞，在肿瘤免疫中发挥重要作 用。T淋巴细胞发挥抗肿瘤效应的前提是其细胞内活化、增殖信号的启动。研宄表明，CD3 分子（clusterofdifferentiation3)是T淋巴细胞活化的关键分子，其细胞内的免疫受 体酪氨酸活化基序（ITAM)可以提供T淋巴细胞活化所需的下游信号。目前，针对CD3分子 的单克隆抗体可以有效诱导CD3细胞内的ITAM磷酸化，从而激活T淋巴细胞。因此，CD3抗 体可以被用作一种提高肿瘤免疫的药物。比如，商品化的CD3抗体0KT-3,当采用低剂量时 已经被用于激活T淋巴细胞，可以提高肿瘤免疫。 当前，单克隆抗体已经成为一类重要的生物技术药物，主要以gamma球蛋白为主， 即IgG型抗体。IgG型抗体由2条重链和2条轻链通过二硫键构成，分子量约150kD。作为 人体治疗用的单克隆抗体主要为IgG型嵌合抗体和采用CDR移植技术构建而成的人源化抗 体。在这些抗体中，原来鼠源的抗体恒定区被替换为人源抗体恒定区，甚至鼠源抗体可变区 中框架区的部分氨基酸也被替换为人源抗体基因的氨基酸。通过这些改造，在一定程度上 减少了原来鼠源抗体疗法引起的HAMA(Humanantimousantibody)效应，提高了临床治疗 效果。尽管如此，由于抗体可变区的部分氨基酸仍然为鼠源序列，因此无法完全避免HAM 效应的发生。 从抗体药物应用来说，人源抗体是用于人体治疗最理想的抗体，可以有效减少 抗-抗体的产生，这可以避免提高抗体药物的耐药。但是由于技术上的难度，目前世界上成 功的人源抗体极少。首先，由于伦理限制，无法采用类似制备小鼠杂交瘤细胞的方法借助人 体生产人源抗体。其次，目前世界上转人源抗体基因的工程小鼠极少，更为关键的是由于抗 体多样性产生的过程需要重链V-D-J基因重排和轻链V-J基因重排，而人抗体基因重排过 程在小鼠体内受到很大限制，因此导致抗体的多样性受限。另外，抗体库技术近年来也被用 于筛选人源抗体，但是由于缺乏类似人体内生发中心中的抗体亲和力成熟过程，因此产生 的抗体亲和力常常较低。然而，由于人源抗体独特的优势和巨大的治疗价值，目前已经成为 抗体药物发展的重要方向。已经上市的阿达木单抗（adalimumab)就是通过抗体库技术产 生的人源单克隆抗体，用于治疗自身免疫性疾病，已经获得了巨大成功。近年来，基因工程抗体发展迅速，其中单链抗体（single-chainvariable fragment，scFv)就是一种重组小分子抗体。单链抗体由重链可变区和轻链可变区通过一 条柔性连接肽构成，其大小仅为完整IgG型抗体的1/6,因而具有较好的组织渗透性。由于 体积较小，单链抗体也经常与其他效应分子融合，作为重组蛋白药物的靶向识别域，因此单 链抗体具有十分广阔的应用前景。尽管如此，由于缺乏抗体恒定区的支撑，因此并非所有单 链抗体都能够保留有效的抗体结合活性，需要进行检验证实。而且，多数单链抗体的结合活 性不足，往往需要进一步优化，因此获得具有足够结合活性的单链抗体是比较有挑战性的 工作。 鉴于此，本专利技术提供了一种CD3单链抗体，特别的是，其重链和轻链可变区来源于 人类抗体胚系基因，因此组成此CD3单链抗体的氨基酸为人源抗体序列。本专利技术的CD3人 源单链抗体能够结合并靶向CD3阳性的T淋巴细胞。更重要的是，此抗体为全人源序列，可 以有效地避免临床治疗应用中的HAM发生。为本领域的具体提供了一种新的有效选择，具 有很好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种抗人CD3的人源单链抗体，其能够结合 ⑶3阳性的T淋巴细胞。 本专利技术首先提供了一种抗人CD3的抗体轻链可变区，其氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO. 4所示。 本专利技术还提供了一种抗人⑶3的抗体重链可变区，其氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO. 2 所示。 上述的两段序列均为本专利技术首次获得的人源化序列。 在获得了上述人源化序列的基础上，本专利技术提供了一种抗人CD3的单链抗体，该 单链抗体是是由上述的抗人CD3的抗体轻链可变区和抗人CD3的抗体重链可变区连接而 成。 轻链可变区和重链可变区的排列方式为VH-VL或VL-VH，VH位于单链抗体的N端， VL位于单链抗体的C端，表示为CD3ScFv-VHVL。VL位于单链抗体的N端，VH位于单链抗体 的C端，表示为CD3ScFv-VLVH， 其中，上述抗人CD3的单链抗体中，所述的抗人CD3的抗体轻链可变区和抗人CD3 的抗体重链可变区之间通过连接肽进行连接。连接肽可用本领域常用的各种连接肽。 其中，上述抗人⑶3的单链抗体中，其结构可选的为轻链可变区-重链可变区、重 链可变区-轻链可变区、轻链可变区-连接肽-重链可变区或重链可变区-连接肽-轻链 可变区中的任意一种。 其中，在上述抗人CD3的单链抗体中，所述的连接肽的氨基酸序列为 GGGGSGGGGSGGGGS或VEGGSGGSGGSGGSGGVD。 优选的，上述抗人⑶3的单链抗体的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 6或SEQ IDNO. 8 所述。 本专利技术还提供了编码上述抗人CD3的抗体轻链可变区的基因。本专利技术提供了编码 上述述抗人CD3的抗体重链可变区的基因。本专利技术还提供了编码上述的的抗人CD3的单链 抗体的基因。 其中，上述的编码抗人CD3的抗体轻链可变区的基因，其核苷酸序列如序列表中 的SEQIDNO. 3或其简并序列所示。 上述的编码抗人⑶3的抗体重链可变区的基因，其核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO. 1或其简并序列所示。 其中，上述的编码抗人CD3的单链抗体的基因，其核苷酸序列如序列表中的SEQID NO. 5或7所示，或为它们的简并序列所示。 在上述方案的基础上，本专利技术还提供了上述编码基因的重组载体。这些种族载体 可以选自质粒或病毒。 本专利技术也进一步地提供了包含上述重组载体的宿主细胞。所述宿主细胞可是真核 细胞或原核细胞。 本专利技术还提供了上述的抗人CD3的单链抗体在制备T淋巴细胞结合剂中的应用。 本专利技术的有益效果在于：提供了一组抗体重链和轻链可变区的序列，由该重链可 变区和轻链可变区重组而成的单链抗体具有结合CD3的生物学活性，从而能够靶向CD3阳 性的T淋巴细胞。【附图说明】 图1?本专利技术⑶3单链抗体的人类胚系基因（germlinegene)来源。 图2.本专利技术⑶3单链抗体的蛋白空间结构示意图。 图3.本专利技术⑶3单链抗体重组载体示意图。 图4本专利技术⑶3单链抗体的表达鉴定和纯化分析。左：免疫印迹检测细胞培养上 清中CD3单链抗体的表达。右：细胞培养上清通过镍柱亲和纯化，凝胶电泳显示高纯度的 ⑶3单链抗体。 图5.流式细胞术分析本专利技术CD3单链抗体的靶向结合活性。上：阴影峰为阴性对 照，中间线形峰为⑶3单链抗体，最右侧线形峰为商品化⑶3抗体。下：阴影峰为阴性对照， 线形峰为CD3单链抗体。 图6.ELISA分析本专利技术⑶3单链抗体的靶向结合活性。<当前第1页1 2&本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗人CD3的抗体轻链可变区，其特征在于：氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：勾蓝图，杨金亮，魏于全，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51