一种重组抗菌肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于医药领域，公开了一种重组抗菌肽及其制备方法和应用。该重组抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该多肽具有较好的广谱抗菌作用，可用于制备抗菌药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药领域，涉及。
技术介绍
经过2亿年的进化，母乳喂养以及其独特的产物母乳依然哺育保护着新生的婴 儿。母乳中大量的蛋白对致病菌、病毒和真菌具有抑制作用。其中一些蛋白可以单独发挥 作用，而另一些蛋白则必须协同发挥作用。多种成分作用于同一种病原菌貌似是一种冗余， 其实际是一种多重保护系统。体内蛋白酶的水解作用产生了大量的母乳多肽，这些母乳多 肽除了提供氨基酸作为营养还发挥作用的生理功能。进一步研宄发现大量的母乳多肽展现 出多重的抗微生物作用，为新生提供免疫保护。 随着抗生素的大量应用，细菌耐药性的产生和新生抗生素的筛选瓶颈使得抗生素 的应用受到一定的制约。近年来的研宄发现，抗菌肽（Antimicrobalpeptides,AMPs)以其 独特的作用机理和分子特性成为有望替代传统抗生素的理想药物。作为一种新型抗菌物 质，AMP有着广谱抗菌活性，能快速杀死细菌，且对一些临床相关的可导致严重感染的病原 体及耐药菌株有效。母乳作为重要资源，含有丰富的具有潜在抗菌功能的多肽成为大家研 宄的对象。 我们借助超滤技术分离出母乳中小于IOKDa的多肽成分，进一步借助串联质谱技 术对其具体组成进行鉴定分析。结果发现这些多肽主要是从人0-酪蛋白（Homosapiens betacasein，基因Bank号：NM_001891)中断裂下来的片段，天然存在于母乳中。现有技术 中没有对这些片断及其功能进一步研宄的报道，为此，我们筛选了一些多肽进行深入的研 宄。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述技术问题提供一种重组抗菌肽。 本专利技术的另一个目的是提供上述重组抗菌肽的制备方法。 本专利技术还有一个目的是提供上述重组抗菌肽的应用。 本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的： -种重组抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。命名为Casein41。 表达上述抗菌肽的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。 所述多肽的扩增引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，下游引物 的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。 所述抗菌肽的制备方法，该方法包括下列步骤： a.构建上述多肽的表达载体pSUMO; b.pSUMO融合蛋白的诱导表达； c.pSUMO融合蛋白的纯化、收集； d.重组抗菌肽的纯化、收集。 所述的制备方法，该方法包括以下步骤：a.构建上述多肽（SEQIDNO:1)的表达载体pSUMO: 人工合成该多肽核酸序列，利用上述的上下游引物通过PCR技术扩增出含有 Bsal、HindIII酶切位点的该多肽核酸片段进行胶回收，回收产物双酶切后载入pSUMO载 体； b.pSUMO融合蛋白的诱导表达： 1)测序正确的质粒转入大肠杆菌BL21，接种于含卡那霉素的LB培养液培养； 2)收集菌体，重悬后加入IPTG诱导pSUMO融合蛋白表达； c.pSUMO融合蛋白的纯化： 诱导表达后的菌液沉淀用Ni-NTABinding-Buffer重悬后，超声破碎，离心，取上 清，上清液上样至Ni-NTA亲和层析柱，洗脱pSUMO融合蛋白，收集洗脱液，SDS-PAGE电泳分 析； d.重组抗菌肽的纯化、收集： 采用SUMO酶对pSUMO融合蛋白进行酶切，利用Ni-NTA亲和层析柱去除SUMO标签 或没有被切割的SUMO融合蛋白，洗脱重组抗菌肽，电泳分析，收集重组抗菌肽。 所述的重组抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。所述的抗菌药物所针对的病菌为致 病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌。 本专利技术的有益效果： 本专利技术提供的多肽具有较好的抗病菌作用，可用于制备抗菌的药物。 本专利技术提供的多肽也可以通过化学合成得到，但是合成的成本高，且不利于大规 模生产制备。因此，本专利技术还提供了该多肽的基因重组技术制备方法，该制备方法简单易 行，成本低，易于产业化应用。由于SUMO除了具有传统融合标签的促进可溶性的特性外，还具有分子伴侣功能， 能促进目的蛋白的正确折叠等特点，同时对热和蛋白酶有很强的抗性，有利于保持目的蛋 白的稳定性。本研宄中我们成功构建了多肽与SUMO融合表达载体，并对其表达条件进行了 优化表，融合蛋白经SUMO酶酶切、柱纯化后可大量获取可溶性多肽，与化学合成比大大降 低了获取多肽的成本。 随着抗生素的大量使用，细菌产生广泛的耐药性。本专利技术中抗菌肽对青霉素耐药 金黄色葡萄球菌和头孢菌素耐药肺炎克雷伯菌均具有杀伤作用。因此，有望成为替代传统 抗生素的理想替代药物。【附图说明】图I:SUM0融合蛋白SDS-PAGE。 其中：M:蛋白Marker;1 :破碎上清；2 :流出液；3 :洗涤液；4 :洗脱液。 图2 :切割后纯化后的重组多肽Tricine/SDS-PAGE电泳。 其中:蛋白Marker;2:切割后的重组多肽。 图3 :重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌耐药菌的杀伤活性。【具体实施方式】 以下通过实施例对本专利技术作进一步的阐述。 实施例1 1.该多肽具有一下的序列特征：氨基酸序列：ELLLNPTHQIYPVTQPLAPVHNPIS(SEQIDNO:1) 核苷酸序列： GAACTTCTACTTAACCCCACCCACCAGATCTACCCTGTGACTCAGCCACTTGCCCCAGTTCATAACCCC ATTAGT(SEQIDNO：2) 具有等电点（pi) :5. 99,分子量（Mw) :2792. 23。 2.重组制备方法的建立 2. 1载体构建： 人工合成该多肽核酸序列，借助PCR技术利用下面引物： NOl-F：CATATCGGTCTCGAACTTCTACTTAACCCCA(SEQIDNO：3)BsaI NOl-R：CCCAAGCTTACTAATGGGGTTATGAACTG(SEQIDNO：4) HindIII 扩增出含有上述酶切位点的该多肽核酸片段进行胶回收，回收产物双酶切后载入 pSUMO载体（Lifesensors，USA)，转入DH5a感受态细胞，抽取质粒后送公司测序。2. 2pSUMO融合蛋白的诱导表达 1.测序正确的质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3)涂板，挑取转化平板上的单克隆接种 于含30yg/mlKan(卡那霉素）的3mlLB培养液的试管中，37°C200rpm振摇过夜； 2.次日按1 :100接种于30yg/ml卡那霉素的50mlLB培养液中，37°C200rpm振 摇至菌体0D600为0. 6 (约2. 5h); 3.取出200y1培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用20yI2X上样缓冲液 (0? 5MNaCl，20mMTris, 20mM咪唑）重悬菌体沉淀； 4.向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mmol/l，25°C220rpm振摇6h，诱导 pSUMO融合蛋白（命名为pSUMO-NO: 1融合蛋白）表达； 5.取出200y1培养物，12000g室温离心3min，弃上清，用20yI2X上样缓冲液 重悬菌体沉淀，剩余培养物4°C5000g离心20min，弃上清，置-80°C冻存。 2. 3pSUMO融合蛋白的纯化当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：崔县伟，尤梁惠，郭锡熔，季晨博，陈婷，
申请(专利权)人：南京市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：江苏;32