抑制ADAMTS-5和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抑制ADAMTS-5基因和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用。本发明专利技术公开一种化学修饰的双链siRNA分子组合物，该组合物含有如下(1)所示的双链siRNA分子中的至少一种和(2)所示的双链siRNA分子中的至少一种。本发明专利技术公开的siRNA组合物可以作为关节炎及相关炎症的治疗药物，可通过骨关节腔局部注射siRNA组合物及其制剂抑制炎症因子表达实现对关节炎症的治疗。

【技术实现步骤摘要】
抑制ADAMTS-5和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用
本专利技术涉及一种抑制ADAMTS-5基因和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用，属于生物

技术介绍
骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种严重危害人类健康，目前尚缺乏有效治疗手段的慢性退行性骨关节病变，迫切需要研究出能有效防治骨关节炎的新方法。骨关节炎临床病理特征之一是软骨破坏和hFLS细胞外基质降解，而软骨的破坏最终都来源于胞外基质的蛋白水解。因此多种蛋白水解酶活性增高引起继发性软骨外基质(extracellularmatrix,ECM)的降解异常是软骨退变的直接原因，最终导致覆盖关节骨表面的软骨破坏。白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)都有促进hFLS细胞分解代谢及降解细胞外基质的作用，有研究表明在关节炎患者的关节液中发现高浓度的IL-1和TNF-α,它们被认为是在关节炎发病机制中起关键作用的促炎细胞因子。含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶家族(adisintegrin-likeandmetalloproteinasewiththrombospondintype1motifs，ADAMTS)，由一组结构相似的分泌性锌结合蛋白酶组成，目前已发现19个成员。它们的蛋白结构具有高度的相似性,蛋白在氨基端信号肽序列后都为前蛋白域结构,蛋白酶原需在胞内经过翻译后的剪切才能成为有活性的蛋白酶。而且它们都包含有至少一个保守的TSP1样重复基序。位于蛋白酶羧基端的TSP样重复基序是与细胞外基质成分结合的重要部分。ADAMTS家族在体内以多种细胞外基质成分为底物，它们在胚胎发育、血管生成、凝血、炎症反应等生理过程中具有重要功能。ADAMTS-5(含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶家族-5)是软骨基质蛋白聚蛋白多糖aggrecan的降解酶。关节软骨中含有大量的aggrecan,它对于关节的抗压力和张力等物理属性起着重要的作用。骨关节炎和类风湿性关节炎患者中发现存在着aggrecan的大量降解破坏。在aggrecan的结构域中有两个主要的切割位点,其中一个是MMPs切割位点,位于Asn341和Phe342；而另一个则是聚蛋白多糖酶aggrecanase切割位点,位于Glu373和Ala374。ADAMTS-5定位于人21q21-q22。聚蛋白多糖酶是治疗关节炎的新靶点，它的发现使得关节炎的治疗有望取得新的突破，为能从根本上治疗和预防关节炎提供了基础。脂肪组织也可以产生ADAMTS-5。脂肪细胞的形成和分化中可见ADAMTS-5及其底物aggrecan表达水平的变化,aggrecan在体外及体内均可以刺激脂肪细胞分化和成熟,提示ADAMTS-5在脂肪的形成中起着重要的作用。在恶性胶质瘤中,ADAMTS-5的表达水平明显升高,通过降解aggrecan介导了神经胶质瘤的侵袭与转移。另外，已知蛋白聚糖酶在其中发生细胞外蛋白降解或者破坏的其它疾病中起作用，例如癌症、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化、与年龄有关的黄斑变性、心肌梗塞、角膜溃疡和其它眼表面疾病、肝炎、主动脉瘤、腱炎、中枢神经系统疾病、异常伤口愈合、血管生成、再狭窄、肝硬变、多发性硬化症、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、糖尿病、炎性肠病、休克、椎间盘变性、中风、骨质减少和牙周病。ADAM17(解聚素-金属蛋白酶17)是ADAMs家族(解聚素和金属蛋白酶)的一员，ADAMs家族是近年来发现的一类具有多种功能的细胞膜表面糖蛋白家族，它们共同参与细胞与细胞、细胞与基质的黏连、细胞融合、胞外基质的降解及信号传导等多种生理过程，如白细胞的迁移。除此之外，它们还参与了肿瘤形成、增殖及转移等病理过程[MochizukiS]。ADAM17将膜结合型的TNF-α切断，产生游离型的TNF-α，因此被称作为TNF-α转换酶(TACE)。游离型的TNF-α引起炎症性细胞因子的过量分泌、细胞凋亡、细胞内信号传导的障碍等,导致各种疾病，包括风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症、急性感染病、哮喘、特应性皮炎、牛皮癣等。ADAM17除以TNF-α为底物外，巨噬细胞集落刺激因子或趋化因子FKN也受ADAM17的调节。因此，认为抑制ADAM17的化合物有望作为炎症疾病的治疗药。然而，金属蛋白酶家族高度保守，开发选择性的小分子抑制剂已经被证明具有非常大的挑战。先前使用更广谱的金属蛋白酶抑制剂的试验已经被证明具有组织毒性，因此开发高度选择性的ADAM17抑制剂(Moss，2008)是需要解决的问题。1998年克雷格·梅洛和安德鲁·法尔发现了基因沉默现象，随后Tuschl和他的同事在哺乳动物细胞中发现化学合成的19－25个碱基的小干扰RNA(siRNA)，可特异高效的沉默靶mRNA。从此siRNA被广泛用于基因功能研究，疾病治疗。siRNA可特异的同序列互补的靶mRNA结合，并使其降解。长片段的双链RNA被Dicer酶切割成21－23个碱基长度短片段RNA。两条链中同靶mRNA结合的链称为反义链，另一条链称为正义链或信使链。体外化学合成的siRNA进入细胞后同样发挥RNA干扰作用，而且有效降低了长链RNA引起的免疫反应。但针对同一基因不同片段位置可设计出多种siRNA，沉默效果有明显差异。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抑制ADAMTS-5基因和ADAM17基因的siRNA组合物及其应用。本专利技术提供一种化学修饰的双链siRNA分子组合物，该组合物含有如下(1)所示的双链siRNA分子中的至少一种和(2)所示的双链siRNA分子中的至少一种：(1)如下A’和B’中至少一种双链siRNA分子的至少一条链经过如下1)-13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子；(2)如下A和B中至少一种双链siRNA分子的至少一条链经过如下1)-13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子；A’、SEQIDNo.1所示的RNA单链和SEQIDNo.2所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；B’、SEQIDNo.2所示的RNA单链和与SEQIDNo.1所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；或，SEQIDNo.1所示的RNA单链和与SEQIDNo.2所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；或，与SEQIDNo.2所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQIDNo.1所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；A、SEQIDNo.7所示的RNA单链和SEQIDNo.8所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；B、SEQIDNo.8所示的RNA单链和与SEQIDNo.7所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；或，SEQIDNo.7所示的RNA单链和与SEQIDNo.8所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；或，与SEQIDNo.7所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQIDNo.8所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化学修饰的双链siRNA分子组合物，该组合物含有如下(1)所示的双链siRNA分子中的至少一种和(2)所示的双链siRNA分子中的至少一种：(1)如下A’和B’中至少一种双链siRNA分子的至少一条链经过如下1)‑13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子；(2)如下A和B中至少一种双链siRNA分子的至少一条链经过如下1)‑13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子；A’、SEQ ID No.1所示的RNA单链和SEQ ID No.2所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；B’、SEQ ID No.2所示的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；或，SEQ ID No.1所示的RNA单链和与SEQ ID No.2所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；或，与SEQ ID No.2所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.1所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；A、SEQ ID No.7所示的RNA单链和SEQ ID No.8所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；B、SEQ ID No.8所示的RNA单链和与SEQ ID No.7所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；或，SEQ ID No.7所示的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有60％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；或，与SEQ ID No.7所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No.8所示的RNA单链有70％以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；1)磷酸骨架的硫代磷酸修饰；2)核糖或脱氧核糖的2’‑甲氧基修饰；3)核糖或脱氧核糖的2’‑氟修饰；4)锁核酸修饰；5)开环核酸修饰；6)吲哚修饰；7)碱基的5－甲基胞嘧啶修饰；8)碱基的5‑乙炔基尿嘧啶修饰；9)单链5’末端胆固醇修饰；10)单链3’末端半乳糖修饰；11)单链5’末端多肽修饰；12)单链5’末端磷酸化修饰；13)单链5’末端荧光标记修饰。...

【技术特征摘要】
1.一种化学修饰的双链siRNA分子组合物，该组合物含有如下(1)所示的双链siRNA分子中的至少一种和(2)所示的双链siRNA分子中的至少一种：(1)SEQIDNo.1所示的RNA单链和SEQIDNo.2所示的RNA单链，其中至少一条链经过如下1)-13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子；(2)SEQIDNo.7所示的RNA单链和SEQIDNo.8所示的RNA单链，其中至少一条链经过如下1)-13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子；1)磷酸骨架的硫代磷酸修饰；2)核糖或脱氧核糖的2’-甲氧基修饰；3)核糖或脱氧核糖的2’-氟修饰；4)锁核酸修饰；5)开环核酸修饰；6)吲哚修饰；7)碱基的5－甲基胞嘧啶修饰；8)碱基的5-乙炔基尿嘧啶修饰；9)单链5’末端胆固醇修饰；10)单链3’末端半乳糖修饰；11)单链5’末端多肽修饰；12)单链5’末端磷酸化修饰；13)单链5’末端荧光标记修饰。2.一种化学修饰的双链siRNA分子组合物，含有如下siRNA分子1和siRNA分子2：siRNA分子1：该siRNA分子1的正义链和反义链分别为如下(1)和(2)所示的结构：(1)5'-K-LLMUUUAUGUGGGCAUPMQdTdT-3’；(2)5'-R-MQLAUGCCCACAUAAAQPPdTdT-3’；所述K为无修饰或5’末端胆固醇修饰；所述R为5’末端磷酸化修饰；所述dT为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；所述L、M、P和Q分别为脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和核糖的2’-甲氧基修饰的尿嘧啶核糖核苷酸；或，所述L、M、P和Q分别为脱氧核糖的2’-甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2’-甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和核糖的2’-甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的尿嘧啶核糖核苷酸；siRNA分子2：siRNA分子2的正义链和反义链分别为如下1)和2)所示的结构：1)5'-K’-L’P’M’UCAUGUAUCUGAAP’M’M’dTdT-3’；2)5'-R’-Q’Q’...

【专利技术属性】
技术研发人员：张必良，米其·托尔托雷，王喆，杨秀群，王秋云，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44