耦合核酸扩增反应、核酸侵入反应及纳米颗粒显色反应的封闭式可视化核酸检测新方法技术

本发明专利技术公开了耦合核酸扩增反应、核酸侵入反应及纳米颗粒显色反应的封闭式可视化核酸检测新方法。本发明专利技术的检测方法包括1）靶核酸扩增和信号转化阶段，将靶核酸序列进一步扩增并将对靶核酸的检测转化为对发卡探针片段的检测；2）纳米探针杂交阶段，在扩增反应结束后，在相应的条件下特殊纳米探针将产生聚集或分散的现象,利用该现象可实现对靶核酸的区分检测。利用本发明专利技术检测方法，能够对核酸靶序列进行检测，并且由于核酸侵入反应具有很高的特异性，可以实现对侵入位点附近的单个碱基差异的核酸序列进行区分检测，因此，该发明专利技术不仅可以应用于对模板的检测还可应用于对仅有单碱基区分的SNP分型以及基因突变中。

【技术实现步骤摘要】
耦合核酸扩增反应、核酸侵入反应及纳米颗粒显色反应的封闭式可视化核酸检测新方法
本专利技术属于分子生物学领域，涉及耦合核酸扩增反应、核酸侵入反应及纳米颗粒显色反应的封闭式可视化核酸检测新方法。
技术介绍
目前基于对核酸的检测技术已经广泛应用于临床诊断、环境监测以及传染性疾病的预防与控制等很多方面，例如聚合酶链式反应技术（PolymeraseChainReaction，PCR）技术，该技术可以实现模板的指数扩增，放大百万倍，但是这类技术通常由于特异性的限制，使得不能满足于对一些区分单碱基靶核酸的样本检测，例如，在检测基因突变的样本时，由PCR发展起来的实时PCR（RealTimePCR，RT-PCR）技术不仅特异性有限，区分度低，需要专门的仪器设备，而且检测成本也较高。而基于信号放大的核酸侵入反应是依赖于一种特殊的核酸内切酶的信号扩增反应，该反应不仅特异性好，还具有恒温、反应成本低的优点，目前已经有一种基于核酸侵入反应和生物纳米金技术相偶联进行分子检测的技术（见专利“级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法”，专利申请号“201110161736.3”），但由于该技术灵敏度低，仅能检测模板含量为6×104拷贝/μL以上的样本，仍不能满足绝大多数临床样本直接检测的要求。因此，在实际样本的检测过程中，还需要对待测模板进行预先PCR扩增，开管后取出扩增产物，然后再进行核酸侵入反应和生物纳米金显色反应；但是开管后取出扩增产物极易造成扩增产物的交叉污染，出现假阳性结果。假阳性结果是临床中绝对应该避免的，为此我们专利技术了在单管中依次完成扩增反应、侵入反应和显色反应的方法，无需开管操作，避免了开管造成的扩增产物的交叉污染。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的极易造成假阳性结果的不足，提供一种通过控制反应温度的方式实现核酸扩增反应、序列特异性核酸侵入反应以及生物纳米颗粒显色反应在同一管中依次进行，实现对核酸模板中的特定序列进行闭管比色检测的方法。本专利技术通过温度控制实现将核酸扩增反应与核酸侵入反应（Invasivereaction）以及生物纳米颗粒显色反应相偶联依次在同管闭管中进行，利用核酸修饰的纳米颗粒聚集状态的改变对检测结果进行区分，建立了一种高灵敏度、高特异性、低成本且便捷的可视化核酸检测新方法。通过耦合核酸扩增反应、序列特异性核酸侵入反应和生物纳米颗粒显示反应，对核酸模板中的特定序列进行比色检测的方法，反应前加入核酸扩增反应、核酸侵入反应和生物纳米显示反应所需的成分，通过控制反应温度实现基于三个反应的同管闭管检测核酸模板；在反应过程中，通过控制温度条件，优先进行核酸扩增反应扩增出核酸侵入反应所需的靶序列，接着进行核酸侵入反应切割产生靶序列特异性的核酸片段，最后通过核酸探针修饰的纳米颗粒（图5）进行杂交反应并对被切割的核酸片段进行比色检测，当待测样本中存在靶核酸序列时纳米颗粒呈分散状态，否则呈聚集状态；所述的控制反应温度实现核酸扩增反应、核酸侵入反应和生物纳米显示反应同管闭管进行，并且优先进行核酸扩增反应扩增出核酸侵入反应所需的靶序列，要求核酸扩增反应的最低温度要高于核酸侵入反应的反应温度至少3℃，优选5-10℃；所述的核酸侵入反应的反应体系包括针对靶核酸特异性的一对探针，核酸5’外切酶或5’flap内切酶、以及一个发卡探针；所述的靶核酸特异性的一对探针要求与靶核酸杂交后，上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，下游探针5’端有一段翘起片段，称为5’flap片段，利用核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶能够特异识别DNA双链中上游探针侵入下游双链至少一个碱基形成的探针-待测核酸特异性结构（图1），并将下游探针5’flap片段连同被侵入的碱基切断，而形成的5’flap片段又与发卡探针进行杂交，进一步形成为核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶能够特异识别DNA双链中上游探针侵入下游双链的“侵入结构”（图4），从而将发卡探针切成两个部分，随着5’flap片段的积累，被切开的发卡探针也进一步积累；所述的下游探针（图2），其3’和5’端是分别可以与纳米颗粒表面修饰的两种探针互补的序列，中间部分为模板序列特异的互补序列。所述的发卡探针（图3），其3’和5’端是分别可以与纳米颗粒表面修饰的两种探针互补的序列，毗邻3’端与纳米颗粒表面修饰的探针互补片段的序列与flap片段互补形成侵入一个碱基的flap-发卡探针特异性侵入结构；被切开的发卡探针能够与所述的两种核酸探针修饰的纳米颗粒杂交而使纳米颗粒保持分散状态。本专利技术所述的核酸扩增反应可以是指聚合酶链式反应PCR、核酸环介导等温扩增反应LAMP、依赖核酸序列的扩增NASBA、恒温指数扩增方法EXPAR、滚环扩增反应RCA、连接扩增反应LCR、解旋酶依赖的核酸扩增反应HDA，优选聚合酶链式反应进行核酸扩增。本专利技术所述的通过耦合核酸扩增反应、序列特异性核酸侵入反应和生物纳米金显示反应，对核酸模板中的特定序列进行比色检测的闭关检测方法，具体技术方案如图6以及图7所示，优选包括以下步骤：1）设计并合成核酸扩增反应使用的核酸模板特异性的扩增引物对，核酸侵入反应使用的针对靶核酸特异性的一对探针和一个发卡探针（或者一条上游探针、一条两端带有与纳米颗粒探针互补序列的下游探针），以及能够与发卡探针（或者与两端带有与纳米颗粒探针互补序列的下游探针）杂交的两种核酸探针修饰的纳米颗粒；其中，所述的针对靶核酸特异性的一对探针，要求与靶核酸杂交后，上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，下游探针5’端有一段翘起片段，称为5’flap，并且其中下游探针与靶核酸互补区域的解链温度在核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度±1℃范围内，而上游探针与靶核酸互补区域的解链温度要高于核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度5～10℃；2）向同一管中加入包含步骤1）涉及的引物、探针以及核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶在内的核酸扩增反应、核酸侵入反应和生物纳米显示反应的反应体系；3）通过控制核酸扩增反应的最低温度要高于核酸侵入反应的反应温度至少3℃，实现优先进行核酸扩增反应扩增出核酸侵入反应所需的靶序列，接着进行核酸侵入反应切割产生靶序列特异性的核酸片段，最后通过核酸探针修饰的纳米颗粒进行杂交反应并对被切割的核酸片段进行比色检测，具体过程为：a）模板序列扩增阶段：通过核酸扩增反应扩增出核酸侵入信号扩增所需要序列长度的靶核酸；b）核酸侵入反应信号转化阶段：所述的靶核酸与所述的靶核酸特异性的一对探针在核酸侵入反应体系中杂交形成探针-靶核酸特异性结构，反应体系中的核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶会识别所述的探针-靶核酸特异性结构，并将下游探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，因为所述的酶切反应温度接近下游探针与模板配对部分的熔解温度，下游探针被切割后会很快与靶核酸分离，没有被切割的完整的下游探针会再次与靶核酸杂交，而上游探针熔解温度高于反应温度，牢固地结合在靶核酸上，与新杂交的完整的下游探针再次形成所述的探针-靶核酸特异性结构，进而继续被核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶切割，形成flap片段的积累；而切割形成的fla本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过耦合核酸扩增反应、序列特异性核酸侵入反应和生物纳米颗粒显示反应，对核酸模板中的特定序列进行比色检测的方法，其特征在于反应前加入核酸扩增反应、核酸侵入反应和生物纳米颗粒显示反应所需的成分，通过控制反应温度实现核酸模板的单管密封式检测，即先在较高温度条件下优先进行核酸扩增反应扩增出核酸侵入反应所需的靶序列，接着通过降低温度进行核酸侵入反应产生靶序列特异性的核酸片段，最后再通过降低温度使末端连接纳米颗粒的核酸探针与反应体系中的互补序列杂交，当待测样本中存在靶核酸序列时被切割的核酸片段使纳米颗粒呈分散状态，否则呈聚集状态，通过对最终反应产物的比色检测实现结果的判断。

【技术特征摘要】
1.通过耦合核酸扩增反应、序列特异性核酸侵入反应和生物纳米颗粒显示反应，对核酸模板中的特定序列进行比色检测的方法，其特征在于反应前加入核酸扩增反应、核酸侵入反应和生物纳米颗粒显示反应所需的成分，通过控制反应温度实现核酸模板的单管密封式检测，即先在高于核酸侵入反应的反应温度3℃以上的温度条件下优先进行核酸扩增反应扩增出核酸侵入反应所需的靶序列，接着通过降低温度进行核酸侵入反应产生靶序列特异性的核酸片段，最后再通过降低温度使末端连接纳米颗粒的核酸探针与反应体系中的互补序列杂交，当待测样本中存在靶核酸序列时被切割的核酸片段使纳米颗粒呈分散状态，否则呈聚集状态，通过对最终反应产物的比色检测实现结果的判断；其中所述的核酸侵入反应，是指针对靶核酸特异性序列分别设计一条上游探针和一条下游探针，当上下游探针与靶核酸杂交后，要求上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，其中下游探针两端各有一段翘起片段，分别称为5’flap和3’arm，当体系中存在待测靶标时就形成核酸侵入结构，下游探针被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切断产生游离的5’flap和含有3’arm的游离片段；所述的纳米颗粒选自13nm的纳米金颗粒；所述的纳米颗粒表面被核酸修饰后，还需进一步用巯基修饰的PEG或类似物、硅烷化试剂、寡肽或者其他有机小分子进一步封阻纳米颗粒表面未被探针结合的部分；所述的连接纳米颗粒的核酸探针以及核酸侵入反应中的下游探针，其3’端需修饰C3、C6、C12、C18、磷酸基、氨基、生物素、炔基、叠氮基、双脱氧核糖核苷酸、偶氮苯。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于要求核酸扩增反应的最低温度要高于核酸侵入反应的反应温度5-10℃。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的通过降低温度进行核酸侵入反应切割产生靶序列特异性的核酸片段，要求核酸侵入反应的反应温度较之核酸扩增反应的最低温度降低3℃以上。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于要求核酸侵入反应的反应温度较之核酸扩增反应的最低温度降低5-10℃。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的通过降低温度使末端连接纳米颗粒的核酸探针与反应体系中的互补序列杂交，要求降低温度3℃以上。6.据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的通过降低温度使末端连接纳米颗粒的核酸探针与反应体系中的互补序列杂交，要求降低温度5-10℃。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的核酸扩增反应选自聚合酶链式反应PCR、核酸环介导等温扩增反应LAMP、依赖核酸序列的扩增NASBA、滚环扩增反应RCA、连接扩增反应LCR中的任意一种。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的核酸扩增反应选自聚合酶链式反应PCR。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的生物纳米颗粒显示反应，是指分别设计两种一端修饰有纳米颗粒的核酸探针，要求能分别与权利要求1中的下游探针5’flap和3’arm互补杂交，当待测样本中存在靶核酸序列时被切割的5’flap和含有3’arm的核酸片段使纳米颗粒呈分散状态，否则呈聚集状态，最终反应产物中纳米颗粒聚集状态的不同会使溶液的颜...

【专利技术属性】
技术研发人员：周国华，王建平，邹秉杰，
申请(专利权)人：周国华，
类型：发明
国别省市：江苏;32