血液中循环癌细胞的检测信号放大的方法与试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种信号放大检测血液中循环癌细胞的试剂盒和方法、以及人乳腺癌细胞的检测试剂盒，所述信号放大检测血液中循环癌细胞的试剂盒包括有：偶联循环癌细胞上抗原的特异性抗体1的探针A；偶联循环癌细胞上抗原的特异性抗体2的探针B；连接探针A和探针B的连接子。该试剂盒基于连接酶激活型探针，通过对CTCs的检测信号放大，可实现对血液中循环癌细胞的高灵敏度和高特异性的检测。

【技术实现步骤摘要】
血液中循环癌细胞的检测信号放大的方法与试剂盒
本专利技术涉及生物检测领域，具体是涉及一种血液中循环癌细胞的检测信号放大的方法与试剂盒。
技术介绍
肿瘤转移是导致肿瘤复发和难以根治的重要原因。而肿瘤的微转移（micrometastasis）是指少数具有转移潜能的肿瘤细胞脱离原发灶，转移到血液、淋巴结、骨髓或远处器官中。目前临床的检测手段很难发现这种微转移。相关研究表明，在癌症发展的早期，已有微转移发生。循环癌细胞（circulatingtumorcells，CTCs）是自发或因诊疗操作，由实体瘤或转移病灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发或远处转移的重要标志。CTCs的早期检测有助于早期发现肿瘤的微转移、监测术后复发、评估疗效及预后或选择合适的个体化治疗。目前CTCs检测的主要方法有传统细胞学方法，聚合酶链反应（PCR），流式细胞分选（fluorescence-activatedcellscanning/sorting,FACS），免疫磁性分离（magnetic-activatedcellseparation,MACS），稀有细胞自动检测系统，以及基于表面拉曼增强（SERS）和量子点的新方法。传统的免疫细胞化学检验方法CTCs是目前公认的标准方法。但由于CTCs在外周血中的数量常小于1/106，如果通过常规的细胞涂片方法，理论上，每份标本将需要制备1000张涂片才可能检测到CTCs。而通过反转录-PCR方法检测癌变组织特异性标志的mRNA来间接确定血液中的CTC的存在。由于实验污染，非常规转录，采血过程中其它来源细胞的污染，以及PCR本身的特点决定该方法的假阳性非常高[12]。因此在进行检测前对CTCs进行快速有效富集是该技术的关健。目前的细胞富集方法主要有基于流式细胞术和免疫磁性分离技术。流式细胞术筛选细胞的速度为103-104/秒，CTCs在外周血中的数量稀少，为提高阳性率长需要检测107-108个单个核细胞，这样一次筛选需要几小时，速度慢，试剂消耗也非常大，难以常规应用。而免疫磁性分离的细胞筛选速度可以达到106-107/秒，适合大量细胞的筛选，富集后的细胞可以在一张载玻片上进行免疫细胞化学分析，也可以进行流式检测。此方法比单纯采用RT-PCR或免疫组化法敏感性高10-100倍，从而减少了假阳性和假阴性。荧光显微镜为基础的稀有细胞自动检测系统其主要的特点是能够快速的分析大量的显微镜视野，并将信息以数字模式储存图像，通过坐标系统记录靶细胞在载玻片上的位置，进一步通过普通光学显微镜分析细胞的形态。通过此系统检测外周血单个核细胞中CTCs阳性的灵敏度和特异性都非常高。CTCs的出现可能发生在肿瘤发生及转移的早期，因此它的检出有可能成为一种比目前常规的肿瘤诊断方法（病理学，影像学和血清学）更早的肿瘤诊断手段。但是由于CTCs在外周血中的数量极少，而且容易与白细胞混淆，目前的检测的方法还很难达到临床的标准。因此急需发展一种能够灵敏，准确，快速的检测CTCs的新方法。邻近连接技术（proximityligationassay,PLA）是由瑞典乌普萨拉大学的LandegrenU课题组最早发展起来的一项基于核酸的蛋白检测新技术。该方法利用一对邻近探针(proximityprobes)对靶分子进行双识别，在连接子的作用下，这对邻近探针通过连接反应形成新的模板序列。这一可扩增的模板序列能以PCR的方式进行放大和检测。两个偶联有寡核苷酸的连接探针通过抗原-抗体反应分别与目标蛋白结合，与连接探针上不同的寡核苷酸序列有互补结构的连接子的加入，使2个探针上的寡核苷酸因为与同一个连接子杂交而形成长的新杂交链。通过连接酶的连接反应，有缺口的杂交链被连接成完整的长链。而此时通过PCR扩增可以简单地实现对目标蛋白X的级联放大检测。邻近连接技术的最大优点在于它结合了实时定量PCR的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异性。邻近连接技术将对蛋白质的检测转变成为对扩增DNA的检测，因此具有极高的检测灵敏度，而且邻近连接反应的苛刻条件（双探针必须同时结合到目标蛋白，且相互间距离足够贴近时,邻位连接反应才能够发生）使得PLA技术与一般的ELISA,免疫PCR或其它蛋白检测方法相比，具有更高的特异性。该技术自首次报道后发展迅速，现已经广泛应用到蛋白质定量分析及蛋白质-核酸相互作用研究等研究中，并初步形成了商品化检测试剂盒。可以直接分析复杂生物样品中的微量蛋白质。本专利技术通过构建了一种新型的连接酶激活型探针来检测血液中CTCs。这种方法利用一对亲和探针对CTCs上特异抗原进行双识别，在连接酶的作用下发生接近连接，继而产生可通过PCR扩增而得到的检测信号，从而将对CTCs上特异抗原的检测转变成为对DNA的检测，实现对血液中CTCs放大检测。针对现有肿瘤细胞及循环癌细胞检测中存在的上述矛盾，本专利技术所要解决的技术问题之一是提供一种连接酶激活型探针来检测血液中CTCs的方法。这种方法利用一对亲和探针对CTCs上特异抗原进行双识别，在连接酶的作用下发生接近连接，继而产生可通过PCR扩增而得到的检测信号，从而将对CTCs上特异抗原的检测转变成为对DNA的检测，实现对血液中CTCs分析。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种血液中循环癌细胞的检测信号放大的试剂盒。实现上述目的的技术方案如下。一种信号放大检测血液中循环癌细胞的试剂盒，包括有：c）偶联循环癌细胞上抗原的特异性抗体1的探针A；d）偶联循环癌细胞上抗原的特异性抗体2的探针B;c）连接探针A和探针B的连接子。本专利技术的另一目的是提供一种人乳腺癌细胞的检测信号放大试剂盒。实现上述目的的技术方案如下。一种人乳腺癌细胞的检测信号放大试剂盒，包括有：a）偶联抗体Trastuzumab抗体的探针A，所述探针A的碱基组成如SEQIDNO.1所示,b)偶联单链抗体Anti-HER2-scFv的探针B,所述探针B的碱基组成如SEQIDNO.2所示，c）碱基组成如SEQIDNO.2所示的连接子。在其中一个实施例中，还包括有连接酶。本专利技术的另一目的是提供一种一种人乳腺癌检测试剂盒。实现上述目的的技术方案如下。一种人乳腺癌检测试剂盒，包括有：a）偶联抗体Trastuzumab抗体的探针A，所述探针A的碱基组成如SEQIDNO.1所示,b)偶联单链抗体Anti-HER2-scFv的探针B,所述探针B的碱基组成如SEQIDNO.2所示，c）碱基组成如SEQIDNO.2所示的连接子；D）碱基组成如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物。本专利技术的另一目的是提供一一种血液中循环癌细胞的检测信号放大的方法，它具有定量、快速、简便、准确地检测肿瘤细胞及定量细胞表面特异受体密度的优点。实现该目的的技术方案如下。一种血液中循环癌细胞的检测信号放大的方法，包括以下步骤：（1）将探针A偶联有血液中循环癌细胞上的抗原的特异性抗体1，（2）将探针B偶联血液中循环癌细胞上的抗原的特异性抗体2，所述特异性抗体2与特异性抗体1不相同；（3）将血液中循环癌细胞与步骤（1）中的所述探针A和步骤（1）中的所述探针B孵化，所述探针A和所述探针B分别通过抗原抗体结合，结合到细胞上；（4）加入连接子，探针A与探针B互补杂交；（5）加入连接本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种信号放大检测血液中循环癌细胞的的试剂盒，其特征是，包括有：a）偶联循环癌细胞上抗原的特异性抗体1的探针A；b）偶联循环癌细胞上抗原的特异性抗体2的探针B;c）连接探针A和探针B的连接子。

【技术特征摘要】
1.一种人乳腺癌细胞的检测信号放大试剂盒，其特征是，包括有：a)偶联抗体Trastuzumab抗体的探针A，所述探针A的碱基组成如SEQIDNO.1所示,b)偶联单链抗体Anti-HER2-scFv的探针B,所述探针B的碱基组成如SEQIDNO.2所示，c)碱基组成如SEQIDNO.3所示的连接子。2.根据权利要求1所述的人乳腺癌细胞的检测信号放大试剂盒，其特征是，还包括有连接酶。3.根据权利要求1所述的人乳腺癌细胞的检测信号放大...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡林涛，龚萍，杨月婷，孟晓靑，张鹏飞，胡德红，盛宗海，高笃阳，罗震宇，刘朋，王碧，吕亚琳，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44