本发明专利技术涉及家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)基因定点突变与蛋白制备方法和应用，本发明专利技术所述的猪肿瘤坏死因子(TNF-α)的一个突变体基因，它具有SEQ ID NO.2所示的序列。此突变体基因翻译蛋白氨基酸序列具有SEQ ID NO.3所示的序列，将此突变体连接到pET28a原核表达质粒中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达，Ni+-NTA柱纯化后得到的重组蛋白His6-PmTNF-α，CCK-8、LDH检测等实验均证明该突变体蛋白与TNF-α野生型蛋白相比，能够明显增强对L929细胞的细胞毒活性并降低对正常细胞L02的毒副作用。
【技术实现步骤摘要】
家猪肿瘤坏死因子突变体的构建及蛋白表达纯化方法
本专利技术涉及生物基因工程领域，具体涉及家猪肿瘤坏死因子突变体基因的构建、表达、蛋白纯化及活性鉴定技术。
技术介绍
肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF-α)是1975年发现的一种具有抗肿瘤效果的细胞因子，是迄今发现的对肿瘤细胞杀伤性最好的细胞因子，属于肿瘤坏死因子超家族成员。TNF-α除对肿瘤细胞具有直接的抑制增殖和细胞坏死作用外，对其他细胞(包括心肌细胞)的生长分化也有影响，同时还有抗病毒及细菌感染；刺激T细胞、B细胞、单核巨噬细胞等，使其功能增强；诱发炎症反应，促进IL1、IL2、IL6等的产生及分泌；促进EGFR及主要组织相容性抗原Ⅱ类抗原(MHCⅡAg)等的表达等，在宿主防御反应中起重要作用。TNF-α主要是通过与靶细胞膜上肿瘤坏死因子受体(tumornecrosisfactorreceptor,TNFR)结合,实现其细胞毒性、抗病毒细菌感染、免疫调节等生物学功能，具有广泛的生物学活性。人用TNF-α能被肾脏快速排泄及被各种蛋白酶分解,在体内半衰期很短(15-30min),而发挥作用需要12-36h。若频繁大剂量注射,则会导致严重的不良反应,如发热、恶心呕吐、头痛、低血压等,甚至能引起休克、死亡。TNF-α在人体的耐受量仅为其有效量的1/10～1/50。因此,用TNF-α治疗癌症被局限于肿瘤组织内给药,以获得较高的局部浓度。为了更好的利用TNF-α，提高其生物学活性，降低其系统毒副作用，近年来，国内外科学家通过定点突变技术对TNF-α基因进行定点突变，从而达到增加TNF-α活性并降低其毒性的目的。2003年第四军医大学生物技术中心的张英起教授通过蛋白质工程技术对TNF-α重组改造之后获得高活性低毒性的新型突变体，突变后的肿瘤坏死因子与天然重组人肿瘤坏死因子相比，毒性降低了100到1000倍，但对肿瘤细胞的杀伤活性和抑瘤作用达到60％以上。该研究已经获得国家一类新药物制品证书，这是目前世界上第一个被批准生产的重组改构人肿瘤坏死因子药物，也是我国第一个上市的一类基因工程抗肿瘤药物。肿瘤坏死因子(TNF-α)作为迄今为止发现的抗肿瘤效果最好的细胞因子，一直是国内外研究的热点，但是几乎所有的研究都是围绕着人TNF-α，很少涉及到家畜的肿瘤坏死因子。猪是我国肉类重要来源，是我国畜类养殖业的重要组成部分，但是近年来，猪的一些常见病(如发热、痢疾甚至猪瘟、蓝耳病、口蹄疫等)对其养殖的影响日益严重。本课题从国内外研究的现状以及增强猪的免疫力和抗病毒细菌感染的方面考虑，提出对猪TNF-α基因进行突变体构建、原核重组表达及功能进行研究，针对免疫力低下和炎症感染疾病的猪，有望开发成相关的免疫增强剂和疫苗佐剂。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种家猪肿瘤坏死因子突变体基因(PmTNF-α)构建方法，并提供家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体蛋白的表达及纯化方法和活性检测。本专利技术所述猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体基因序列如SEQIDNO.2所示，突变基因翻译蛋白氨基酸序列和野生型相比，N端缺少7个氨基酸，第8位的Ser、第9位的Asp和第156位的Ile分别突变为Lys、Arg和Phe，其序列如SEQIDNO.3所示。家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体基因构建方法如下：(1)提取猪脾脏组织总RNA，并逆转录为第一链cDNA；(2)设计包含突变位点的大片段引物：F1：5’-AAGCGCAAGCCCGTCGCCCA-3’(SEQIDNO.4)R1：5’-TCAGAAGGCAATGATCCCAA-3’(SEQIDNO.5)(3)将上述引物的PCR扩增产物，克隆入pMD-19T载体(TaKaRa)，并进行碱基序列测定，得到了猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体基因序列(PmTNF-α)。本专利技术还公开了一种重组表达载体pET28-mTNF-α的构建方法，以猪第一链cDNA为模版，F2、R2为引物进行PCR，F2、R2的序列如SEQIDNO.6和SEQIDNO.6所示，得到目的基因，即带酶切位点家猪肿瘤坏死因子突变体基因PmTNF-α，和pET28a载体用BamHⅠ和HindⅢ酶切,T4DNALigas连接酶切后的载体和目的基因，得到pET28-PmTNF-α重组质粒。一种家猪肿瘤坏死因子突变体蛋白的表达纯化方法，包括以下步骤：(1)把含有pET28-PmTNF-α重组质粒的菌种复苏、扩大培养及诱导表达取-80℃冻存菌种50μl接种到加有5μlKan的5mlLB培养基中复苏12小时，把复苏后的菌液加到500ml灭菌LB培养基中，并加500μlKan抗生素，37℃，200rpm，摇2h；加1MIPTG100μl，使终浓度达到0.2mM，16℃，150rpm，诱导20h。收菌，-70℃，冻存过夜。(2)超声破碎：30mlPBS重悬冻存菌体，超生破碎，4℃，12000rpm，离心20min，收集上清。(3)镍柱层析：配制洗脱缓冲液20mM、50mM、100mM、250mM咪唑各200ml，先用20mM咪唑平衡柱子，上样结束后，开始洗脱。先用20mM咪唑洗脱，之后分别用50mM、100mM咪唑洗脱，最后250mM，此时洗脱峰为目的蛋白。(4)透析并浓缩：将收集到的250mM咪唑洗脱蛋白，放到透析袋中，于4℃，1LPBS中透析24小时，之后用PEG20000浓缩到合适浓度。本专利技术进一步公开了所述家猪肿瘤坏死因子突变体基因PmTNF-α的重组应用，是通过基因工程方法，生产重组His6-PmTNF-α蛋白，作为猪免疫增强剂或相关疾病的免疫佐剂，或者生物药物制剂。通过现有基因工程方法将该基因的胞外功能区克隆连接到pET28a原核质粒中并转到大肠杆菌BL21(DE3)中表达，本专利技术通过多次预表达实验摸索出了合适的表达条件(调节IPTG的浓度、温度及转速使融合蛋白尽可能多的以可溶形式表达)，超声破碎后离心收集上清过Ni+-NTA柱纯化，梯度洗脱之后我们得到了家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体蛋白(His6-PmTNF-α)。并进行Western-blot鉴定。体外WST-8染料生物活性检测及LDH检测结果显示，该突变型蛋白和野生型蛋白相比不仅提高了对肿瘤细胞L929的细胞毒活性，而且降低了对正常细胞(L02)的细胞毒性。附图说明图1重组质粒图(A、野生型TNF-α，B、突变型TNF-α)图2镍柱层析洗脱图(A、野生型重组蛋白，B、突变型重组蛋白)图3家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)成熟区片段表达及纯化、Westernblot鉴定图(M、蛋白Maker，1、未诱导，2、诱导，3、纯化后蛋白，4、Westernblot结果。A、野生型重组蛋白，B、突变型重组蛋白)图4CCK-8法分析不同浓度家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)对L929细胞的细胞毒活性。(PwTNF-α为野生型重组蛋白，PmTNF-α为突变型重组蛋白)图510×10倍倒置显微镜下拍摄L929细胞图6酶标仪法分析猪肿瘤坏死因子(TNF-α)对L02细胞的毒副作用。具体实施方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种家猪肿瘤坏死因子TNF‑α突变体基因，其特征在于它的序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种家猪肿瘤坏死因子TNF-α突变体基因，其特征在于它的序列如SEQIDNO.2所示。2.一种由权利要求1所述家猪肿瘤坏死因子TNF-α突变体基因编码的蛋白，其特征在于它的序列如SEQIDNO.3所示。3.一种家猪肿瘤坏死因子TNF-α基因定点突变方法，其特征在于包括以下步骤：(1)提取家猪脾脏组织总RNA，试剂盒转录为第一链cDNA(2)设计长片段引物进行突变体基因的构建正义寡核苷酸引物F1：5’-AAGCGCAAGCCCGTCGCCCA-3’反义寡核苷酸引物R1：5’-TCAGAAGGCAATGATCCCAA-3’(3)以F1、R1为引物，逆转录所得的cDNA为模板，进行PCR扩增；所得的PCR产物克隆入pMD-19T载体，并进行碱基序列测定；得到家猪肿瘤坏死因子—TNF-α—突变体基因，其序列SEQIDNO.2所示。4.一种重组表达载体pET28-mTNF-α的构建方法，其特征在于：以猪第一链cDNA为模版，F2、R2为引物进行PCR，F2、R2的序列如SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示，得到目的基因，即带酶切位点家猪肿瘤坏死因子突变体基因PmTNF-α，和pET28a载体用BamHⅠ和HindⅢ酶切,T4DNALigas连接酶切后的载体和目的基因，得到pET28-PmTNF-α重组质粒。...
【专利技术属性】
技术研发人员：张双全，朱善元，杨林，赵东伟，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。