本发明专利技术提供了一种睫状神经营养因子突变体及其修饰型突变体和用途。其中，所述的睫状神经营养因子突变体是通过在睫状神经营养因子的氨基酸序列的基础上，保留了第17位的半胱氨酸，将第63位的谷氨酰胺突变为精氨酸，并且去除了C末端的15个氨基酸而得到的。通过本发明专利技术的睫状神经营养因子突变体能够获得修饰专一性高的修饰型睫状神经营养因子，从而克服因修饰而带来的如修饰产物不均一，结果不稳定等系列问题，并使重组CNTF蛋白结构更为稳定，与天然蛋白相比具有更高的生物学活性和可溶性，并且修饰型睫状神经营养因子与未修饰型睫状神经营养因子相比具有长效作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体而言，涉及一种修饰型睫状神经营养因子突变体、 DNA、重组表达载体、遗传工程宿主细胞、修饰型睫状神经营养因子突变体、所述睫状神经营 养因子突变体以及修饰型睫状神经营养因子突变体的用途、药物组合物。
技术介绍
睫状神经营养因子（Ciliaryneurotrophicfactor,简称为CNTF)是一种小分子 蛋白，全长由200氨基酸组成，分子量在23KD左右。CNTF在体内以两个二聚体形式进行储 存，经过酶解成单体后发生生物学作用。CNTF可以促进包括运动神经元、感觉神经元、交感 神经元、海马神经元等多种神经细胞和神经胶质细胞的生长和分化。CNTF因为最初是从鸡的睫状体中提取出来，并可维持鸡副交感神经节的存活而得 名。90年代，在将人源CNTF用于治疗肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS)的实验研究中发 现，对一组ALS患者进行临床研究发现病人的体重大大降低，使用药物组体重比安慰剂组 明显降低。CNTF曾被用来治疗肌萎缩侧索硬化症（ALS)，但因副反应太大及疗效不确切而 终止了临床实验，但在实验中意外地发现用药者的体重都明显下降。后Regeneron公司根 据这一发现，开发了重组人CNTF药物并已完成肥胖症的三期临床实验，并取得了统计学上 具有显著性差异的结果。研究表明CNTF可通过激活位于下丘脑的受体而对机体的体重设 定点进行调节，从而起到减少摄食、减轻体重的作用。针对这一结果进行在肥胖症领域进 行实验，结果表明CNTF在体内可与下丘脑的特异性受体结合，激活抑制食欲的关键信号通 路，抑制进食欲望且使机体不会产生饥饿感，从而使体重减轻。研究发现，CNTF具有多种功 能，能促使多种神经细胞的存活、营养肌肉，促进糖、脂代谢和调节能量平衡以及摄食行为。 在神经系统，肌肉系统，肥胖症极其相关疾病的治疗中具有重要意义和广阔的临床前景。 而由于CNTF在治疗或预防肥胖症及其相关疾病中存在半衰期短，活性较低的缺 陷，目前现有技术中已开发出了各种CNTF的突变体（或称变异体），因此CNTF突变体的常 规制备方法对于本领域技术人员是已知的。 例如中国专利申请公开No.CN1687413A公开了一种CNTF突变体（hCNTF)，该 hCNTF的第17位的半胱氨酸替换为丙氨酸；第63位的谷氨酰胺替换为精氨酸；第64位的 组氨酸替换为丙氨酸；去除hCNTF的C末端1-30个氨基酸。此外，CN1687413A还公开了一 种CNTF突变体，其第17位半胱氨酸变为丝氨酸，并去掉C端的16个氨基酸。 中国专利申请公开No.CN1387568A公开了一种商品化的CNTF突变体--Axl5,其 63位的谷酰胺酸被突变为精氨酸、而且C末端的15个氨基酸被取代，以及第17位的半胱氨 酸被替换。 而上述CNTF突变体虽然在治疗或预防相关疾病的活性有所提高，但是仍存在半 衰期短，免疫原性高以及活性较低的缺陷，临床中需要多次注射才能获得令人满意的疗效， 这给病人带来巨大的经济压力、精神压力和身体反应。因此，目前急需开发出一种具有较高 活性且疗效时间较长的CNTF突变体药物势在必行。 而现有技术中已知使用聚乙二醇（PEG)修饰蛋白的方法有如下益处：分子量增 大、半衰期延长、免疫原性降低。PEG拥有独特的亲-疏水平衡。当偶联到药物分子表面 时，将其优良性质赋予修饰后的药物，改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其 修饰的药物周围产空间屏障，减少药物的酶解。覆盖蛋白表面的抗原决定簇，降低蛋白的免 疫原性。增加蛋白的分子量和体积，减少肾小球的滤过作用，使蛋白在体内作用时间更长。 PEG于1940年首次商业生产化。PEG的使用通过了美国FDA认证，符合美国药典（USP)、国 家处方集（NF)、食品化学法典（FCC)标准，被广泛应用于食品、饲料、个人护理品、化学、医 药化工等生产生活领域。因此，人们希望使用PEG或PEG类聚合物对CNTF进行修饰，以提 高药物的疗效，延长药物在体内作用的时间，并降低使用次数。 例如，中国专利申请公开No.CN101185762A公开了一种使用PEG类聚合物修饰 CNTF突变体的方法。但是由于CNTF突变体中，具有极性的氨基酸残基的侧链基团均能够进 行化学修饰，即在CNTF或CNTF突变体中至少有赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和肽链的N-端氨基和C-端羧基等。因此，在实践中发 现使用PEG类聚合物对CNTF或CNTF突变体的修饰位点不稳定，结果造成很难获得修饰后 性状均一的修饰产物。
技术实现思路
为解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种修饰型睫状神经营养因子 突变体、DNA、重组表达载体、遗传工程宿主细胞、修饰型睫状神经营养因子突变体、所述睫 状神经营养因子突变体以及修饰型睫状神经营养因子突变体的用途、药物组合物。 具体而言，本专利技术提供： (1) 一种睫状神经营养因子突变体，其中，所述的睫状神经营养因子突变体是通过 在睫状神经营养因子的氨基酸序列的基础上，保留了第17位的半胱氨酸，将第63位的谷氨 酰胺突变为精氨酸，并且去除了C末端的15个氨基酸而得到的。 (2)根据（1)所述的睫状神经营养因子突变体，其中，所述的睫状神经营养因子突 变体具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。 (3) -种DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列为编码根据⑴或⑵所述的睫状神 经营养因子突变体的核苷酸序列。 (4)根据⑶所述的DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列为SEQIDNO:4所示的核 苷酸序列。 (5) -种重组表达载体，其中，所述重组表达载体含有（3)或（4)的核苷酸序列。 (6)根据（5)所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为如图1所示的 PET24a+/CNTFnew/CC22 表达载体。 (7) -种遗传工程宿主细胞，其中，所述宿主细胞含有（5)或（6)所述的重组表达 载体。 (8)根据（7)所述的遗传工程宿主细胞，其中，所述宿主细胞为CNTFnew/CC22工程 菌。 (9) -种修饰型睫状神经营养因子突变体，其中，所述的修饰型睫状神经营养因子 是通过对根据（1)或（2)所述的睫状神经营养因子突变体的第17位半胱氨酸进行定点修 饰而得到的，所述定点修饰是通过在所述的第17位半胱氨酸上结合化学修饰剂而实现的。 (10)根据（9)所述的修饰型睫状神经营养因子突变体，其中，所述化学修饰剂为 聚乙二醇或聚乙二醇类聚合物。 (11)根据（10)所述的修饰型睫状神经营养因子突变体，其中，所述的化学修饰剂 选自：聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯、甲氧基聚乙二 醇-琥珀酰亚胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、甲氧基聚乙二醇-丙醛、甲氧基 聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺a甲基丁酸酯、甲氧基聚乙 二醇-N-羟基琥珀酰亚胺、甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺或甲氧基聚乙二醇-乙醛；优选为 甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺。 (12)根据（1)或（2)所述的睫状神经营养因子突变体在制备用于治疗和/或预防 肥胖症及肥胖相关II型糖尿病的药物中的用途。 (13)根据（9)-(11)中任意一项所述的修饰本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种睫状神经营养因子突变体，其中，所述的睫状神经营养因子突变体是通过在睫状神经营养因子的氨基酸序列的基础上，保留了第17位的半胱氨酸，将第63位的谷氨酰胺突变为精氨酸，并且去除了C末端的15个氨基酸而得到的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王健，刘君，李莉莉，郑秀玉，张振龙，
申请(专利权)人：北京生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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