一种酵母中麦角固醇含量的测定方法技术

一种酵母中麦角固醇含量的测定方法，可适用于培养和生长成熟的酵母发酵液进行麦角固醇提取后提取液的测定，也可对酵母粉进行麦角固醇提取后进行测定，本发明专利技术所提供的测定方法测定精度高，测值准确，方法简单易行，为麦角固醇的提取和制备提供了理论依据，在实际应用中具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酵母中麦角固醇含量的测定方法，涉及生物生产工艺领域。
技术介绍
麦角固醇（Ergosterol）的化学名称为24β-甲基胆固醇-5，7烯-3β-羟基，又称麦角甾醇，常温下为固体，熔点为156～158℃，23℃时旋光度为127.5（C=1.2，CHCl3），不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、石油醚、庚烷等有机溶剂。在乙醚中得无水晶体，在乙醇中得片状晶体。麦角固醇在空气中能被氧化。麦角固醇在紫外线照射下可转化为维生素D2前体，加热异构失去两个氢原子而得到VD2。麦角固醇最早是从麦角中提取出来的，目前，国内外生产麦角固醇的方法有2种，酵母发酵法和提取法。前者即是通过培养生产麦角固醇的微生物得到，这也是最常用的方法；后者是从青霉菌丝体中提取麦角固醇。麦角固醇是一种重要的医药和农药原料，主要用来生产VD2、氢化可的松和激素黄体酮等药物，还可用于生产云台素内脂。其中的VD2是一种重要的药品，而且作为饲料添加剂能提高家禽的孵化率和产蛋率。目前国内很多制药厂和饲料厂对麦角固醇的需求量很大，且呈上升趋势，国内麦角固醇的生产状况并不能满足需求。在某些真菌体内，如酵母菌、青霉菌和黑曲霉的菌丝体内含有较多的麦角固醇，其中尤以酵母菌为多。因此，利用酵母菌发酵生产麦角固醇在世界范围内已成了获取麦角固醇的重要手段，其含量主要取决于菌株的遗传特性和培养条件。国内从20世纪50年代开始研究从酵母菌中提取麦角固醇，但普遍存在的问题是菌种麦角固醇含量较低，仅为细胞干重的0.8%-1.2%，与国外有较大差距。由于不同酵母菌细胞中麦角固醇含量差异较大，因此从现有菌株中筛选高产菌株是优良菌株选育的基本方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酵母中麦角固醇含量的测定方法，利用高效液相色谱测定了酵母细胞中麦角固醇含量，本专利技术的技术方案是通过以下方法实现的：一种酵母中麦角固醇含量的测定方法，包括如下步骤：a）麦角固醇的提取：将培养和生长成熟的酵母发酵液摇匀，离心后弃上清，沉淀用蒸馏水离心洗涤后加入醇碱溶液，沸水浴回流，回流结束后，冷却，加乙醚，剧烈震荡，静置，分层后取上层萃取液定容；或取干酵母粉，加碱乙醇皂化，冷却，加正庚烷，提取、水洗至中性，再将正庚烷真空蒸干，乙醇定容；b）将步骤a）定容后的液体取样，高效液相色谱检测麦角固醇含量，高效液相条件为：色谱柱为HYPersil BDS C185u，流动相为甲醇：水，流速1.5～2.0mL/min，检测波长为283nm，采用外标法进行定量。本专利技术所述的测定方法，优选步骤a）中所述醇碱的加入量为10～20mL/g离心后沉淀。本专利技术所述的测定方法，优选步骤a）中所述沸水浴时间为0.5～2h。本专利技术所述的测定方法，优选步骤a）中所述干酵母粉中碱乙醇的加入量为100～200mL/g酵母粉。本专利技术所述的测定方法，优选步骤a）中所述皂化温度为80～95℃，皂化时间为1.5～5h。本专利技术所述的测定方法，优选步骤a）中所述正庚烷的加入量为40～80mL/g酵母粉。本专利技术所述的测定方法，优选步骤b）中流动相甲醇：水为95～98:5～2本专利技术所述的测定方法，优选步骤b）中流动相甲醇：水为97:3。有益效果本专利技术所述的测定方法有效测定出酵母细胞中麦角固醇的含量，为麦角固醇的提取和制备提供了理论依据，在实际应用中具有重要的意义。附图说明图1.实施例1的麦角固醇提取液的高效液相色谱图。具体实施方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。实施例1a）取干酵母粉15g，加150mL碱乙醇于80℃皂化3h，冷却，加60mL正庚烷，进行麦角固醇的提取，水洗至中性，再将正庚烷真空蒸干，用乙醇将提取液定容。b）使用HYPersil BDS C185u，流动相甲醇：水为95:5，流速设为1.6mL/min，检测波长为283nm，进行麦角固醇的测定。在以上实验条件下，麦角固醇的色谱峰与酵母提取液中杂质峰有很好的分离，见图1。实施例2a）取干酵母粉10g，加120mL碱乙醇于85℃皂化2.5h，冷却，加50mL正庚烷，进行麦角固醇的提取，水洗至中性，再将正庚烷真空蒸干，用乙醇将提取液定容。b）使用HYPersil BDS C185u，流动相甲醇：水为97:3，流速设为1.8mL/min，检测波长为283nm，进行麦角固醇的测定。实施例3a）取干酵母粉20g，加140mL碱乙醇于90℃皂化4h，冷却，加70mL正庚烷，进行麦角固醇的提取，水洗至中性，再将正庚烷真空蒸干，用乙醇将提取液定容。b）使用HYPersil BDS C185u，流动相甲醇：水为97:3，流速设为1.8mL/min，检测波长为283nm，进行麦角固醇的测定。另采用外标法以麦角固醇纯品先绘制峰面积-麦角固醇浓度标准曲线，外标法计算提取液中麦角固醇含量。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酵母中麦角固醇含量的测定方法，包括如下步骤：a）麦角固醇的提取：将培养和生长成熟的酵母发酵液摇匀，离心后弃上清，沉淀用蒸馏水离心洗涤后加入醇碱溶液，沸水浴回流，回流结束后，冷却，加乙醚，剧烈震荡，静置，分层后取上层萃取液定容；或取干酵母粉，加碱乙醇皂化，冷却，加正庚烷，提取、水洗至中性，再将正庚烷真空蒸干，乙醇定容；b）将步骤a）定容后的液体取样，高效液相色谱检测麦角固醇含量，高效液相条件为：色谱柱为HYPersil BDS C185u，流动相为甲醇：水，流速1.5～2.0mL/min，检测波长为283nm，采用外标法进行定量。

【技术特征摘要】
1.一种酵母中麦角固醇含量的测定方法，包括如下步骤：
a）麦角固醇的提取：将培养和生长成熟的酵母发酵液摇匀，离心后弃上清，沉淀用蒸
馏水离心洗涤后加入醇碱溶液，沸水浴回流，回流结束后，冷却，加乙醚，剧烈震荡，静置，
分层后取上层萃取液定容；或取干酵母粉，加碱乙醇皂化，冷却，加正庚烷，提取、水洗至
中性，再将正庚烷真空蒸干，乙醇定容；
b）将步骤a）定容后的液体取样，高效液相色谱检测麦角固醇含量，高效液相条件为：
色谱柱为HYPersil BDS C185u，流动相为甲醇：水，流速1.5～2.0mL/min，检测波长为283nm，
采用外标法进行定量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于步骤a）中所述醇碱的加入量为
...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦宏佳，
申请(专利权)人：大连市沙河口区中小微企业服务中心，
类型：发明
国别省市：辽宁;21