转基因苜蓿草J101品系Taqman实时荧光定量PCR检测用引物和探针及检测方法技术

本发明专利技术公开了转基因苜蓿草J101品系Taqman实时荧光定量PCR检测用引物和探针及检测方法。本发明专利技术针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的转基因苜蓿草品系J101，根据5’端邻接区序列设计引物和探针，成功建立了转基因苜蓿草J101品系特异性实时荧光定量PCR检测方法。结果表明，本发明专利技术建立的J101品系特异性实量荧光定量PCR检测方法的标准曲线相关系数、扩增效率及重复性良好，检测最低DNA浓度为16pg，相当于10拷贝转基因苜蓿草J101基因组DNA，定量检测最低DNA浓度为80pg，相当于50拷贝的J101基因组DNA，能够快速、准确、稳定的用于J101品系定性和/或定量检测。

【技术实现步骤摘要】
转基因苜蓿草J101品系Taqman实时荧光定量PCR检测用引物和探针及检测方法
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种转基因苜蓿草J101品系特异性Taqman实时荧光定量PCR检测用引物和探针及检测方法。
技术介绍
目前我国存栏数为1500万头奶牛，对优质饲草需求最非常大。转基因苜蓿通过饲料进入动物养殖的食物链，致使牛奶、肉等制品成为转基因食品，可能对于人的健康产生影响。根据《农业转基因生物标识管理办法》，凡是在中国境内销售的转基因生物，必须进行标识。为保障消费者的知情权，转基因产品标识制度在30多个国家和地区应用。目前各国强制标识的转基因限量各不相同。欧盟和俄罗斯为0.9%，韩国和日本分别是3%和5%，中国目前实施无阀值的强制性标识制度。对转基因产品标识需要检测方法的支撑。目前对转基因产品的检测主要包括对蛋白质和核酸检测两大类，而后者应用最广泛的是荧光PCR检测技术，相较普通PCR技术，它具更高的灵敏度、特异性和稳定性。可通过荧光信号的积累实现实时监测整个PCR进程，而后通过扩增曲线和标准曲线对未知模板进行定性或定量分析。根据扩增目标片段位置的不同，基于核酸基础上的PCR检测又可以分为4种检测策略:1）筛查法：对转基因产品中的启动子、终止子等通用基因进行筛查：2）基因特异性检测：对转基因产品中的外源目的基因进行检测；3）构建特异性检测:对外源目的基因与启动子或终止子的特异连接序列进行检测；4）品系特异性/转化事件特异性检测:对外源片段与宿主基因组DNA特异连接序列进行检测。品系特异性检测方法的基于外源插入片段和宿主基因接合区的边界序列建立特异性的检测方法，品系特异性检测可以区分转化于同一类质粒的不同基因品系。品系性特异性PCR检测方法可以对转基因产品品系进行判定，被认为是最适合转基因标识的检测判定方法。zimmmermanm等首次使用inversePCR策略获得Bt11的接合区序列并建立品系特异性检测方法。目前采用的启动子、终子止或EPSPS结构特异性基因或其组合的筛查检测策略，只能定性的鉴定苜蓿草是否为转基因，但是不能准确的检测其具体的转基因苜蓿草品系，出入境检验监管部门无法对具多个品系的转基因植物进行标识管理。公众也无法具体知道其转基因的具体情况。此外，采用多个基因联合筛查的方式会使人力物力大量增加。转基因苜蓿草J101品系由孟山都公司开发的耐除草剂的转基因品系，2005年美国和加拿大批准环境释放和作为饲料应用，目前我国尚批准其进口。还未获得我国转基因生物安全证书，目前未见到有该作物品系特异性荧光实时PCR检测方法相关文献。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有转基因苜蓿草采用的筛查检测技术不能准确地检测具体的转基因品系、无法对转基因产品进行标识的不足，提供一种转基因苜蓿草J101品系特异性实时荧光PCR检测用引物和探针，其具有高特异性和灵敏度及稳定性，基于所述引物和探针，可成功建立转基因苜蓿草J101品系特异性Taqman实时荧光定量PCR检测方法。本专利技术要解决的另一技术问题是提供转基因苜蓿草J101品系特异性Taqman实时荧光定量PCR检测方法。本专利技术的上述目的通过以下技术方案予以实现：本专利技术通过创造性地分析和大量实验研究总结，在转基因苜蓿草J101品系的5’端外源插入片段P-eFMV与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列，结合序列信息的分析，设计得到一对特异性的引物，以及探针。并确定了精确地检测条件，建立特异性强、灵敏度高、稳定性良好的转基因苜蓿草J101品系特异性Taqman实时荧光定量PCR检测方法。具体地，提供一种转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测用引物J101-1和J101-2，其序列如SEQIDNO.1，SEQIDNO.2所示：SEQIDNO.1：J101-1：5’-GTGTGTACGGATACAAAGTCAAACA-3’。SEQIDNO.2：J101-2：5’-GGGATCAGATTGTCGTTTCC-3’。提供一种转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测用探针J101-p，其序列如SEQIDNO.3所示：SEQIDNO.3：J101-p:5’-FAM-TCGTATTCATGTCATGTGTTTTGTACTGA-TAMRA-3’。提供一种转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：S1.提取DNA作为反应的模板；S2.采用所述的引物和探针进行实时荧光PCR检测；S2实时荧光PCR检测反应体系为20μL：PremixExTaqTM10μL，10μmol/L权利要求1所述的引物各0.4μL，ROXReferenceDyeII0.2μL，权利要求2所述的探针0.6μL，DNA模板1.5μL和ddH2O6.9μL；S2所述实时荧光PCR检测反应程序为：Stage1：预变性95℃30s；Stage2：95℃5s，60℃34s，40个循环，并收集荧光信号。优选地，所述定量检测的方法包括以下步骤：S21.提取转基因苜蓿J101基因组DNA进行梯度稀释，分别加入J101品系特异性引物J101-1和J101-2和探针J101-p，以及内源基因acc的引物和探针，进行扩增；S22.扩增后得到各稀释浓度对应的Ct值，该Ct值与浓度的自然对数（lg）呈线性关系，据此绘制J101标准曲线和acc标准曲线；S23.提取待检样品的基因组DNA，加入本专利技术设计的品系特异性引物J101-1和J101-2和探针J101-p，进行扩增，扩增后得到的Ct值，根据绘制J163的标准曲线，代入其线性方程，可以得到样品转基因的基因组DNA量。所述内源基因acc的引物的序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示；探针的序列如SEQIDNO.6所示。SEQIDNO.4:acc-1:GATCAGTGAACTTCGCAAAGTAC。SEQIDNO.5:acc-2:CAACGACGTGAACACTACAAC。探针为:SEQIDNO.6:acc-p:TGAATGCTCCTGTGATCTGCCCATGC。优选地，S21或S23所述扩增的反应体系为20μL：PremixExTaqTM10μL，10μmol/L内源基因acc的引物各0.4μL，ROXReferenceDyeII0.2μL，内源基因acc的探针0.6μL，DNA模板1.5μL和ddH2O6.9μL；所述检测的反应程序为：Stage1：预变性95℃30s；Stage2：95℃5s，60℃34s，40个循环，并收集荧光信号。本专利技术采用以下方法验证本专利技术方法的特异性、灵敏性和准确性：采用所述引物J101-1和J101-2、所述的探针J101-p对常见作物进行实时荧光PCR检测，测试检测体系特异性；采用所述引物J101-1和J101-2、所述的探针J101-p，对不同浓度的J101基因组DNA进行实时荧光PCR检测，建立标准曲线。同时参考文献（AlexanderTWetal.,2007）选择苜蓿内源基因acc用于检测本专利技术中提取苜蓿草基因组DNA的质量及是否适合进行荧光PCR检测，并对不同浓度的J101基因组DNA进行实时荧光PCR检测，建立acc标准曲线。采用所述引物J101-1和J101-2、所述的探本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因苜蓿草J101品系Taqman实时荧光定量PCR检测用引物J101‑1和J101‑2，其特征在于，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一组转基因苜蓿草J101品系Taqman实时荧光定量PCR检测用引物组和探针，其特征在于，所述引物组为J101-1和J101-2，其序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述探针为J101-p，其序列如SEQIDNO.3所示。2.权利要求1所述转基因苜蓿草J101品系Taqman实时荧光定量PCR检测用引物组和探针在转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方面的应用。3.一种转基因苜蓿草J101品系Taqman实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.提取DNA作为反应的模板；S2.采用权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针进行实时荧光PCR定性和/或定量检测；S2实时荧光PCR检测反应体系为20μL：PremixExTaqTM10μL，10μmol/L权利要求1所述的引物各0.4μL，ROXReferenceDyeII0.2μL，权利要求2所述的探针0.6μL，DNA模板1.5μL和ddH2O6.9μL；S2所述实时荧光PCR检测反应程序为：Stage1：预变性95℃30s；Stage2：95℃5s，60℃34s，40个循环，并收集荧光信号；其中，所述定量检测的方法包括以下步骤：S21.提取转基因苜蓿J101基因组DNA进行梯度稀释，分别加入J101品系特异性引物J101-1和J101-2和探针J101-p，以及内源基因acc的引物和探针，进行扩增；...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘二龙，卢丽，吕英姿，蒋湘，唐婕，樊武疆，姚柏辉，王定国，林惠娇，郑高彬，林学勤，秦焯敏，
申请(专利权)人：中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：广东;44