本发明专利技术提供了一种双特异性抗体、其制备方法及用途。与此同时，还提供了表达人源HER2蛋白的鼠肿瘤细胞系及上述细胞系的用途。本申请的双特异性抗体能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。本发明专利技术的肿瘤细胞体内药效实验是在一个具备完整免疫系统的动物模型中开展的，利用免疫系统细胞对肿瘤进行杀伤，并能有效的反应双特异性抗体介导免疫细胞杀伤肿瘤细胞的药效，为靶向免疫细胞和肿瘤细胞的双特异性抗体药物开发提供一个很好药效评估方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学的
具体地说，涉及双特异性抗体的构建和制备方法， 以及设计建立鼠肿瘤模型，并进行双特异性抗体体外、体内药效和机理的研宄。为双抗体药 物开发过程中药物机理，特别是临床前动物体内药效的研宄提供有力的方法和模型。
技术介绍
双特异性抗体（bispecific antibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的 人工抗体，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb 在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作 用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研宄的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相 关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。然 而，在双特异性抗体药物研发过程中，特别是体内药效研宄，很难建立一种由完整免疫系统 介导的人体肿瘤免疫杀伤的动物模型，因此建立完整的免疫杀伤模型对免疫治疗性双特异 性抗体药物研发显得尤为重要。以下是针对所研宄的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，以及 相关技术发展的一些
技术介绍
介绍。 I. CD3 CD3分子由4种亚基组成：S、e、Y、G，其分子质量分别为18. 9k Da、23. lkDa、 20. 5k Da、18. 7k Da，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肽 链，常与T细胞受体（Tcell rec印tor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体， 结构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含 免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)， 其作用是当TCR识别并结合由MHC(major histo-compatibility complex)分子提呈的抗 原肽后，导致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p561ck磷 酸化，然后可募集其他含有SH2(Scr homology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。 ITAM的磷酸化和与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之 一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。 2. HER2 1981 年 Shih 等（Shih C，Padhy LC，Murray M，et al. Transforming genes of carcinomas and neuroblastomas introduced into mouse fibroblasts. Nature, 1981,290(5803) :261-264.)首次从大鼠神经母细胞瘤基因组中克隆出癌基因 neu，Slamon 等（1987，Science 2;35;177-182)从人 cDNA 文库中分离出 HER2 基因。随后 的序列分析和染色体谱分析发现neu和HER2为同一个基因，习惯上称为HER2/neu基因或 c-erbB-2基因。HER2是人类表皮生长因子受体家族的第2个成员，该家族属于I型受体酪 氨酸激酶，又称ErbB受体家族，其在许多正常和异常表皮细胞的生长、分化和转移过程中 起着重要的调控作用，许多肿瘤的发生、发展和病情轻重与其活性大小密切相关。家族内共 有四个受体：HER1，HER2, HER3和HER4。这些受体可以相互作用产生异源或同源二聚体，激 活细胞内多条信号转导通路，其中J1ER2在细胞信号转导过程中起着重要作用。HER2的结构 包括胞外生长因子的结合区，亲脂的跨膜区和带有调节羧基末端片段的胞内区。J1ER2受体 胞内区有酪氨酸蛋白激酶PTK活性，自身也具有若干酪氨酸残基Tyr磷酸化位点。特异性 生长因子与J1ER2受体结合后可诱导二聚体化并激发受体的交叉磷酸化，磷酸化的受体可 以把细胞外的生长信号迅速转导至核内，刺激控制与细胞分裂有关的基因表达。 HER2定位于人染色体17q21，编码分子量为185kD的跨膜蛋白，具有酪氨酸激酶 RTK活性，正常情况下处于非激活状态，参与细胞正常分化的调节，通常只在胎儿期表达， 成年后，仅在极少数正常组织内微量表达。正常细胞中HER2基因为2个拷贝，基因突变 可将其激活，其扩增将导致转录上调，蛋白合成增加，从而抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细 胞增殖，上调血管内皮生长因子VEGF/血管通透性因子VPF，促进肿瘤新生血管生成，增加 肿瘤细胞侵袭力，破坏机体组织抗侵袭屏障等. Cl in Transl 0ncol，2005,7. (11) :504-511.hHER2蛋白的过度表达也在细胞的分裂、增殖、转化、促进肿 瘤的转移、侵袭、粘附中发挥重要作用. Biochem Biophys Acta, 1994, 1198(2-3):165-184. ]〇 除可发生基因突变或扩增外，上调HER2的表达也可激HER2下游的两个主要信号 转导途径：MAPK通路，PI3K/Akt通路，从而引发瀑布式连锁反应，调节凋亡相关基因，促进 细胞无限增殖分化，抑制凋亡，从而发生癌变。前者主要参与细胞的有丝分裂，后者主要影 响细胞的存活和凋亡。J1ER2可通过MAPK途径活化Ets转录因子家族成员ER81而上调人端 粒末端转移酶逆转录酶hTERT，进而导致细胞端粒末端转移酶异常活化，使细胞转化并进 入永久增殖状态。PI3K活化后，可催化磷脂酰肌醇PI生成PIP2和PIP3,它们 是细胞内重要的第二信使，能激活下游的蛋白激酶Akt/PKB，进一步导致下游BAD蛋白的磷 酸化，从而阻止BAD与凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL组成复合物，同时还诱导叉头转录因子1 磷酸化，从而抑制原凋亡基因的表达。 另外，HER2癌基因也是肿瘤转移驱动因子，HER2过表达能通过启动多种转移相关 机制而增加肿瘤细胞转移能力，如细胞迀移率、体外侵袭力、W型胶原酶活性等，还可以影响 某些黏附分子如上皮细胞妈黏蛋白等的合成，从而促进转移。Carter等（CarterW, Hoying J, Boswell C, et al.HER-2/neu over-expression induces endothelial cell retraction. Int Cancer, 2001, 91 (3) :295-299.)研宄认为，HER2 过表达可使内皮细胞 收缩，细胞间隙增宽，肿瘤细胞易于从内皮细胞间穿越，肿瘤细胞发生移位或转移。多数研 宄认为，HER2基因扩增和（或）蛋白过表达往往提示肿瘤恶性程度高，转移能力强。 J1ER2的过表达常与肿瘤的发生有关，例如： (1)胃癌：胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，预后差，进展期胃癌5年生存率 仅为5%?20%，中位生存时间不超过1年。不同的研宄小组检测HER2蛋白在胃癌中过 表达的比率变异为7%?43%。HER2蛋白在胃癌中的阳性表达与肿瘤分化程度、Lauren分 型及WHO分型有关，与年龄、性别、肿瘤发生部位及临床分期不相关。 (2)乳腺癌：研宄表明，HER2在20%?30%的原发性乳腺浸润性导管癌中有本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括连接的A部分和B部分；其中，A部分包括识别效应细胞表面触发分子的片段，所述细胞表面触发分子选自小鼠的CD3、CD16和CD64；以及B部分包括识别靶细胞表面标志分子的片段，靶细胞表面标志分子选自HER2/neu、EpCAM、CD20、CD30、EGFR和CD133；优选地，A部分包括抗鼠CD3抗体片段，B部分包括抗肿瘤细胞表面抗原HER2的抗体片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王涛，胡柳，罗振，戴晴，刘敬松，范克索，周鹏飞，
申请(专利权)人：武汉友芝友生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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