一株海洋拟双孢藻及其应用和培养方法技术

本发明专利技术公开了一株海洋拟双孢藻及其应用和培养方法，从黄海海水中分离得到的，分类命名为海洋拟双孢藻Amphikrikos marinus，于2014年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCC No. 9814。所述拟双孢藻的采集方法为浮游植物脱网；分离方法采用微吸管吸取、逐级稀释分离及平板涂布法。本发明专利技术的有益效果：与其他作为生物柴油原料的藻种相比，本发明专利技术的海洋拟双孢藻具有很高的油脂含量及生长速率，可以有效降低生物柴油的生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一株海洋拟双孢藻及其应用和培养方法
专利技术属于生物能源领域，涉及一种海洋拟双孢藻及其应用，更具体地，本专利技术涉及一株新的海洋拟双孢藻藻株，其油脂含量高，可用于制备生物柴油、饲料或食用油。
技术介绍
由于地球上的化石能源储量正日益减少，石油资源很有可能会在短时间内便迅速枯竭。化石能源的蕴藏量并不是无穷无尽的，易于开采和利用的化石能源储量已经所剩无几，剩余储量因为开发难度越来越大，从而失去继续开采的价值。在世界能源消费以石油为主导的情况下，如果能源消费结构仍不变化，那么就会发生新一代的能源危机。煤炭资源虽比石油资源储存量要大，但也不是取之不尽用之不竭的。目前除了煤炭之外，能够大规模利用开发的能源还是很少。虽然太阳能的资源是取之不竭源源不断的，但因其开发利用所耗成本高昂，所以在短时间内仍不可能迅速发展得到广泛应用。因此人类必须及时找到一种可以代替非再生矿物能源的新能源，从而将注意力转移到新的能源结构上，尽早探索、研究开发利用新能源资源，这样才能让人类的生活在安定和谐的情况下持续发展下去，而生物柴油正好可以将此问题解决。像生物柴油这种可再生的碳中性能源，有利于环境和经济的可持续发展。目前的研究也表明了微藻是能够完全替代化石柴油的唯一生物柴油。生物柴油和化石燃料本质上都来源于光合作用产物。绿色植物进行光合作用，将水、二氧化碳和其他无机物依靠光能合成各种有机物并释放出氧气，动物和微生物才能生长繁殖。各种生物的油脂都是从植物合成的有机物转化来的。任何形式的来自动物、植物和微生物的脂肪酸都能用作生物柴油的原料。因此，油脂含量高的藻种才是制备生物柴油的最重要原料。利用微藻加工制备生物柴油的关键，一是提高原始藻种的油脂含量，二是通过优化培养尽可能提高微藻细胞的油脂含量。在单细胞微藻的培养过程中，培养基成分、温度、光照强度、pH、培养方式、通气量、盐度等均会影响微藻的生长以及其脂肪酸的含量与组成。温度、光强能影响微藻的光合作用和呼吸作用，从而对其生长及体内生化成分产生影响。微藻具有生长速率快、收获时期短、光合利用率高等特点，利用微藻作为生物柴油原材料有很高的应用前景。高油脂含量、高生长速率的藻株是该环节的关键步骤。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：第一是提供一种海洋拟双孢藻新种；第二是提供海洋拟双孢藻在生物柴油生产中的应用；第三是在于该新种存在种内的内含子存在/缺失多样性，可以作为研究内含子进化的模式生物；第四在于提供上述拟双孢藻的培养方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种海洋拟双孢藻，从黄海海水中分离得到的，分类命名为海洋拟双孢藻Amphikrikosmarinus，于2014年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCCNo.9814。所述拟双孢藻的采集方法为浮游植物脱网；分离方法采用微吸管吸取、逐级稀释分离及平板涂布法。培养方法，其具体操作步骤如下：在海水F/2培养基中富集培养微藻，初始接种密度为1×105个·mL-1，置于光暗比为14h∶10h，光照强度为1100lux，温度为25℃，相对湿度为70％~80%的人工气候箱中培养1-3周，离心海洋拟双孢藻藻液。收获拟双孢藻。优选的，在相对湿度为70％~80%的人工气候箱中培养2周。上述的F/2培养基中每1L海水中含有以下物质：NaNO3：75毫克；NaH2PO4·H2O：5毫克；Na2SiO3·9H2O：20毫克；Na2EDTA：4.36毫克；FeCl3·6H2O：3.16毫克；CuSO4·5H2O：0.01毫克；ZnSO4·7H2O：0.023毫克；CoCL2·6H2O：0.012毫克；MnCL·4H2O：0.18毫克；Na2MOO4·2H2O：0.07毫克；维生素B1：0.1微克；维生素B12：0.5微克；生物素：0.5微克。所述的海洋拟双孢藻在作为研究内含子进化的模式生物上的应用。本专利技术的有益效果：与其他作为生物柴油原料的藻种相比，本专利技术的海洋拟双孢藻具有很高的油脂含量及生长速率，可以有效降低生物柴油的生产成本。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1是本专利技术的海洋拟双孢藻电镜照片及Bodipy染色照片。图2是本专利技术的海洋拟双孢藻的进化树。具体实施方式实施例1一种海洋拟双孢藻，从黄海海水中分离得到的，分类命名为海洋拟双孢藻Amphikrikosmarinus，于2014年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCCNo.9814。所述拟双孢藻的采集方法为浮游植物脱网；分离方法采用微吸管吸取、逐级稀释分离及平板涂布法。培养方法，其具体操作步骤如下：在海水F/2培养基中富集培养微藻，初始接种密度为1×105个·mL-1，置于光暗比为14h∶10h，光照强度为1100lux，温度为25℃，相对湿度为70％~80%的人工气候箱中培养2周，离心海洋拟双孢藻藻液。收获拟双孢藻。上述的F/2培养基中每1L海水中含有以下物质：NaNO3：75毫克；NaH2PO4·H2O：5毫克；Na2SiO3·9H2O：20毫克；Na2EDTA：4.36毫克；FeCl3·6H2O：3.16毫克；CuSO4·5H2O：0.01毫克；ZnSO4·7H2O：0.023毫克；CoCL2·6H2O：0.012毫克；MnCL·4H2O：0.18毫克；Na2MOO4·2H2O：0.07毫克；维生素B1：0.1微克；维生素B12：0.5微克；生物素：0.5微克。总脂测定方法：将离心收集的藻泥置于真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，直至彻底干燥成藻粉。用电子天平称取约40毫克干燥好的藻粉，小心加入到干净的彻底烘干的密封性好的螺口玻璃试管(10mL)中，并记录下藻粉的质量m1。向螺口管中小心加入2mL氯仿、1mL甲醇。剧烈震荡10min，避免液体从螺口管中溅出。离心4000g，10min。吸取上清至新的干净玻璃管中。重复②，③。并将上清合并到同一个玻璃管中。向装有上清的玻璃管中加入1/5体积的NaCl溶液(0.9%),剧烈震荡10min，室温静置30min以促进分层。用1mL注射器彻底地吸取最下面的氯仿层于新的空玻璃管中(提前称重，记为m2)。将玻璃管置于50℃水浴锅中烘干，待氯仿挥发之后再放入电热恒温鼓风干燥箱中干燥。最后称取玻璃管的重量，记为m3。计算总脂重量。总脂含量(%)=(m3-m2)/m1。恒温光照箱中进行静置培养后（未通二氧化碳），该藻的生物量可达到0.8g/L。通过重量法对进入平台期的微藻油脂含量按照上述方法进行测定，结果表明该藻的油脂含量占到干重的50%以上。在未添加任何促油脂合成物质及未进行胁迫处理的条件下，生物量、油脂含量达到如此水平是异常罕见的。对本实施例中的海洋拟双孢藻进行电镜和Bodipy染色，结果见图1。图1可以看出，胞内多含有1-2个油脂滴，且体积异常庞大，甚至能占到整个细胞的80%以上；充分说明该藻种细胞内油脂含量丰富。选取卵囊藻科物种序列，使用Mega4.0软件，采用邻接法构建进化树。具体结果见图2。DH32是海洋拟双孢藻的编号，从进化树上可以看出该藻与amphikrikossp.聚为一支，表明该藻属于拟双孢藻属。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株海洋拟双孢藻，分类命名为海洋拟双孢藻Amphikrikos marinus，于2014年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCCNo.9814。

【技术特征摘要】
1.一株海洋拟双孢藻，分类命名为海洋拟双孢藻Amphikrikosmarinus，于2014年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCCNo.9814。2.权利要求1所述的海洋拟双孢藻在制备生物柴油上的应用。3.一种权利要求1所述的海洋拟双孢藻的培养方法，其特征在于，操作步骤如下：在海水F/2培养基中富集培养微藻，初始接种密度为1×105个·mL-1，置于光暗比为14h∶10h，光照强度为1100lux，温度为25℃，相对湿度为70％~80%的人工气候箱中培养1-3周，离心海洋拟双孢藻藻液，收获海洋拟双孢藻。4.根据权利要求3所述的海洋拟双...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩吉昌，张琳，王松，潘克厚，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37