一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法，其目的是为了解决现有CLB分子印迹聚合物仿生抗体的特异性低和模板分子渗漏的问题。该方法步骤如下：（1）制备CLB衍生物；（2）制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体。本发明专利技术制备的CLB分子印迹聚合物仿生抗体采用共价键聚合，非共价键方式吸附目标物，具有理化性能稳定，特异性强，吸附速率快，不存在CLB分子泄露问题，适合用于仿生免疫分析检测方法的建立。

【技术实现步骤摘要】
一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法
本专利技术涉及一种仿生抗体的制备方法，尤其涉及一种共价型盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法。
技术介绍
盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLB）是一种肾上腺类神经兴奋剂，临床上曾用于防治支气管哮喘、慢性支气管炎等病症。CLB是“瘦肉精”的一种，生物利用率高，能够改变动物体内的代谢途径，促进肌肉和骨骼中蛋白质的合成，加快生长速度，改善胴体品质，增加瘦肉率。但是，CLB易于在动物体内蓄积，在肺、肝、肾等脏器及肌肉和脂肪组织中的残留量较大，残留时间较长，且可通过食物链在人体内蓄积，对机体产生毒副作用，主要表现为心律失常、肌肉震颤、头晕、乏力等，严重的可危及生命。我国和欧盟等多数国家都严禁CLB在畜禽养殖中应用。分子印迹聚合物仿生抗体是通过分子印迹技术（MIT）制备的对目标分子有特异选择性的高分子聚合物，是目前代替生物抗体最理想的材料之一。分子印迹聚合物仿生抗体具有专一识别性、理化稳定性、应用广泛性，在仿生免疫分析、样品前处理、生物传感器及色谱固定相中具有良好的应用前景。目前，以CLB为目标物的分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法有沉淀聚合方法（RongningLiang，QiGao，WeiQin.ChinJAnalChem,2012,40(3):354-358）、溶胶-凝胶聚合方法（WeiDu，ChunmeiLei，SiruoZhang，etal.JPharmaceuticalBiomed,2014,91:160-168）、本体聚合方法（AndersBlomgren，ChristineBerggren，AnnaHolmberg，etal.JChromatogrA，2002,975:157-164）等，这些制备方法都是以非共价聚合方式制备仿生抗体，虽然具有较高的吸附容量和吸附速率，但在应用过程中存在模板分子渗漏及特异性不高的问题。为了克服模板分子的渗漏问题，利用假模板分子代替CLB制备分子印迹聚合物仿生抗体已被成功制备（FengxiaQiao，JingjingDu.JChromatogrB，2013,923-924:136-140；HongyuanYan，SutingLiu，MengmengGao，etal.JChromatogrA，2013,1294:11-16），但是该方法又降低了仿生抗体的特异性，这可能会增加仿生抗体免疫分析检测过程中假阳性现象的发生。
技术实现思路
专利技术目的针对现有技术的上述不足，本专利技术提出了一种新的CLB分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法，旨在解决现有CLB分子印迹聚合物仿生抗体的特异性低及模板分子渗漏问题。技术方案本专利技术是通过以下技术方案来实现的：一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法,其特征在于：步骤如下：（1）制备盐酸克伦特罗（CLB）衍生物：将盐酸克伦特罗溶于二氯甲烷溶剂中，加入三乙胺后滴加甲基丙烯酰氯于二氯甲烷溶液中，混合物室温反应过夜。反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤反应溶液，分出有机相，水相用二氯甲烷洗涤2次，合并有机相后用无水硫酸钠干燥，然后用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂，残余物以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为淋洗液用硅胶柱提纯得到CLB衍生物；（2）制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体：取步骤（1）制备的盐酸克伦特罗衍生物溶于甲醇和乙酸乙酯混合溶液中，磁力搅拌至全部溶解，然后依次加入交联剂和引发剂，待固体全部溶解后吹氮气4~6min除氧，然后将反应容器密封置于65~75oC水浴中聚合45~50h。聚合反应结束后，用研钵将聚合物仿生抗体研至颗粒状，然后置于真空干燥箱中干燥过夜。干燥的聚合物仿生抗体用用盐酸与甲醇的混合溶液（10:1，V:V）超声洗脱72h，然后再用甲醇-冰乙酸混合溶液索氏提取盐酸克伦特罗分子，直至无盐酸克伦特罗检出为止。洗脱完毕后的聚合物仿生抗体在真空干燥箱中干燥后备用。步骤（1）中盐酸克伦特罗与二氯甲烷的摩尔体积比为10mmol:50~55mL；盐酸克伦特罗与三乙胺的摩尔比为1:3.5~4；盐酸克伦特罗与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:2~2.5。步骤（1）中淋洗液石油醚与乙酸乙酯的体积比为3:1。步骤（1）中硅胶柱中所用硅胶直径为200~300目。步骤（2）中盐酸克伦特罗衍生物和交联剂的摩尔比为1:2；甲醇与冰乙酸的体积比为9:1~2；干燥箱的温度为45~50oC；盐酸溶液的摩尔浓度为3mol/L；步骤（2）中聚合物仿生抗体与盐酸-甲醇混合溶液的质量体积比为1g:200mL。步骤（2）中的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯。步骤（2）中的引发剂为偶氮二异丁腈，用量为30~50mg。优点及效果本专利技术具有如下优点及有益效果：本专利技术以化学合成的CLB衍生物为功能单体，采用共价聚合技术制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体，避免了非共价法制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体时模板分子与功能单体比例不确定问题，提高了CLB分子印迹聚合物仿生抗体的特异性；通过盐酸水解仿生抗体中的化学键，洗脱CLB分子后，仿生抗体中保留了与CLB分子空间结构高度互补的孔穴结构和结合位点，吸附时CLB分子又可通过氢键等非共价键结合到仿生抗体中的孔穴结构中，保证了仿生抗体的传质速度。另外，该方法制备的仿生抗体中的CLB需要通过强酸溶液才能释放出来，实际应用过程不会出现强酸环境，所以避免了CLB分子的渗漏问题。附图说明图1为CLB衍生物核磁图。分析结果如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.13(s,2H),6.19–6.09(m,1H),5.80(dd,J=9.9,3.9Hz,1H),5.64-5.66(m,1H),5.28–5.15(m,1H),5.13–4.93(m,1H),4.52(s,2H),4.11–3.91(m,1H),3.63(dd,J=15.7,3.9Hz,1H),2.02–1.89(m,6H),1.51(s,9H)。结果表明CLB衍生物成功制备。图2为CLB分子印迹聚合物仿生抗体（MIP）扫描电镜图。由图可见，CLB分子印迹聚合物仿生抗体的孔穴结构均匀且直径较小。图3为CLB非印迹聚合物仿生抗体（NIP）扫描电镜图。由图可见，非印迹仿生抗体的孔穴较大且呈不规则状。图4为CLB分子印迹聚合物仿生抗体吸附动力学（A）及拟二级动力学方程（B），由图可知，CLB分子印迹聚合物仿生抗体在20min内可达到吸附平衡，吸附过程符合拟二级动力学模型。图5为CLB分子印迹聚合物仿生抗体（MIP）和非印迹聚合物仿生抗体（NIP）等温吸附曲线。图6为CLB分子印迹聚合物仿生抗体和非印迹聚合物仿生抗体吸附CLB和其它四种结构类似物（特布他林、异丙肾上腺素、氨溴索、沙丁胺醇）的选择性吸附实验结果。结果表明，合成的CLB分子印迹聚合物仿生抗体对目标分子CLB有较好的选择识别能力。具体实施方式下面参照附图对本专利技术进行详细的说明：本专利技术是一种高特异性CLB分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法，依次以化学合成方法将甲基丙烯酰氯与CLB分子反应后作为功能单体，以偶氮二异丁腈为引发剂，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体。本专利技术中，目标物CLB与功能单体通过共价键结合，降低了CLB分子印迹聚合物仿生抗体中非特异性位点的数量，提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法,其特征在于：步骤如下：（1） 盐酸克伦特罗衍生物的制备：将盐酸克伦特罗溶于二氯甲烷溶剂中，加入三乙胺后滴加甲基丙烯酰氯于二氯甲烷溶液中，混合物室温反应过夜；反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤反应溶液，分出有机相，水相用二氯甲烷洗涤2次，合并有机相后用无水硫酸钠干燥，然后用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂，残余物以石油醚‑乙酸乙酯混合溶剂为淋洗液用硅胶柱纯化得到CLB衍生物；（2）盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备：取步骤（1）制备的盐酸克伦特罗衍生物溶于甲醇和乙酸乙酯混合溶液中，磁力搅拌至全部溶解，然后依次加入交联剂和引发剂，待固体全部溶解后吹氮气4~6 min除氧，然后将反应容器密封置于65~75℃水浴中聚合45~50 h；聚合反应结束后，用研钵将聚合物仿生抗体研至颗粒状，然后置于真空干燥箱中干燥过夜；干燥的聚合物仿生抗体用盐酸与甲醇的混合溶液（10:1，V:V）超声洗脱72 h，然后再用甲醇‑冰乙酸混合溶液索氏提取盐酸克伦特罗分子，直至无盐酸克伦特罗检出为止；洗脱完毕后的聚合物仿生抗体在真空干燥箱中干燥后备用。

【技术特征摘要】
1.一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法,其特征在于：步骤如下：（1）盐酸克伦特罗衍生物的制备：将盐酸克伦特罗溶于二氯甲烷溶剂中，加入三乙胺后滴加甲基丙烯酰氯于二氯甲烷溶液中，混合物室温反应过夜；反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤反应溶液，分出有机相，水相用二氯甲烷洗涤2次，合并有机相后用无水硫酸钠干燥，然后用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂，残余物以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为淋洗液用硅胶柱纯化得到盐酸克伦特罗衍生物；（2）盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备：取步骤（1）制备的盐酸克伦特罗衍生物溶于甲醇和乙酸乙酯混合溶液中，磁力搅拌至全部溶解，然后依次加入交联剂和引发剂，待固体全部溶解后吹氮气4~6min除氧，然后将反应容器密封置于65~75℃水浴中聚合45~50h；聚合反应结束后，用研钵将聚合物仿生抗体研至颗粒状，然后置于真空干燥箱中干燥过夜；干燥的聚合物仿生抗体用盐酸与甲醇的混合溶液以体积比10:1超声洗脱72h，然后再用甲醇-冰乙酸混合溶液索氏提...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤轶伟，兰建兴，高雪，于志鹏，刘秀英，励建荣，张德福，吕长鑫，
申请(专利权)人：渤海大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21