一种制备高抗逆性酵母菌株的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备高抗逆性酵母菌株的方法，其中，该方法包括：在葡萄糖培养基中，增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白的表达量，所述葡萄糖培养基含有葡萄糖和含乙酸根离子源。通过增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白的表达量，酵母细胞对抑制物的耐受性明显增强，因此，通过本发明专利技术的方法制得了能够在抑制物浓度较高的环境中利用葡萄糖产乙醇的高抗逆性酵母菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种制备高抗逆性酵母菌株的方法
本专利技术涉及一种制备高抗逆性酵母菌株的方法。
技术介绍
由于传统化石能源用量急增，能源紧缺已成为世界性问题，能源多元化发展和加快可再生能源开发已成为世界各国的研发重点，其中，燃料乙醇的生产和应用在经济发展和战略安全上显示出重大意义。以燃料乙醇等替代能源为代表的能源供应多元化战略已成为我国能源政策的重要方向。纤维素是十分丰富而廉价的生物质原料，可以被降解为可发酵性糖，用于燃料乙醇的生产。大力发展生物质燃料乙醇作为可再生能源，有助于缓解石油资源短缺，改善大气环境等问题，在稳定粮食生产、促进农业生产与消费的良性循环和可持续发展等方面具有积极作用。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为单细胞真核生物，具有易培养、生长周期短的特点，已广泛应用于异源基因的表达。虽然普通酿酒酵母能够高效利用葡萄糖产乙醇，但对发酵液中的抑制物和高浓乙醇耐受性(AlmeidaJRMetal.,2007)较差，特别是对纤维素水解液中的抑制成分敏感，使酿酒酵母无法成为木质纤维素乙醇生产的优势菌株。其次，纤维素乙醇生产中，纤维素原料预处理过程产生和残留的降解物会对后续菌株发酵造成不同程度的抑制，其中乙酸、糠醛、酚类和SO42-等抑制因子对酵母有较强毒害作用，会显著抑制细胞的生长及其发酵性能。目前，在纤维素乙醇生产菌种——酿酒酵母的研究领域，大多集中于将各种实验室缺陷型菌种为研究对象进行改造，而缺乏能够应用于生产的野生型酵母模型，能够耐受多重抑制物、具有高抗逆性的酿酒酵母具有更强的实用性，显然，研究能够在葡萄糖培养基中培养的酵母菌株对筛选获得具有上述特性的酵母模型极为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有的酵母菌株抗逆性低的缺陷，提供一种制备高抗逆性酵母菌株的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供一种制备在葡萄糖培养基中具有高抗逆性酵母菌株的方法，其中，该方法包括：在葡萄糖培养基中，增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白的表达量，所述葡萄糖培养基含有葡萄糖和含乙酸根离子源。通过增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白的表达量，酵母细胞对抑制物的耐受性明显增强，因此，通过本专利技术的方法制得了具有较高抗逆性的酵母菌株。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。在本专利技术中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“抗逆性”是指微生物在偏离其最佳生长条件下的环境中的生长和发酵能力，比如较高或较低的温度，较高或较低的pH，较高或较低的渗透压，较高的反馈抑制，有毒物质的存在等环境。本专利技术提供的制备高抗逆性酵母菌株的方法，其特征在于，该方法包括：在葡萄糖培养基中，增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白的表达量，所述葡萄糖培养基含有葡萄糖和含乙酸根离子源。mstngespapegagdsrdpsgflseiigapvtvklnsgivykgdlqsvdgymnialerckevaegrvirnwgdafvrgnnvtyisadna(SEQIDNO:1)本专利技术中，所述培养基可以为各种添加了葡萄糖的酵母培养基，优选情况下，所述葡萄糖培养基含有5-100g/L(优选10-80g/L)的葡萄糖。所述葡萄糖培养基中，以乙酸根的含量计，含乙酸根离子源的含量优选为0.5-60g/L，更优选为2-40g/L。本专利技术中，含乙酸根离子源可以为各种能够提供乙酸根离子的化合物，如水溶性的乙酸和/或乙酸盐，优选为乙酸、乙酸钠、乙酸钾和乙酸铵中的至少一种。根据本专利技术的优选实施方式，所述葡萄糖培养基还可以含有氯化物(可以为氯化钠、氯化钾和氯化铵中的至少一种)、硫酸盐(可以为硫酸钠和/或硫酸钾)、碳原子数为2-8的醛(如糠醛)和碳原子数为6-16的酚(如苯酚)中的至少一种。更优选地，所述葡萄糖培养基还含有25-95g/L(最优选为20-60g/L)的氯化物、0.5-10g/L(最优选为4-6g/L)的硫酸盐、0.1-1g/L(最优选为0.1-0.5g/L)的碳原子数为2-8的醛和0.1-1g/L(最优选为0.1-0.5g/L)的碳原子数为6-16的酚中的至少一种。为了获得抗逆性更佳的酵母菌株，进一步优选地，所述葡萄糖培养基还含有1-6g/L的Na2SO4、20-60g/L的NaCl、10-30g/L的KCl、0.1-0.5g/L的苯酚和0.1-0.5g/L的糠醛中的至少一种。最优选地，所述葡萄糖培养基还含有4-6g/L的Na2SO4、35-40g/L的NaCl、20-30g/L的KCl中的至少一种(优选最多不超过两种)；或者，所述葡萄糖培养基还含有0.15-0.3g/L的糠醛；或者，所述葡萄糖培养基还含有0.2-0.4g/L的苯酚。本专利技术中，所述葡萄糖培养基还可以含有5-20g/L的蛋白胨和2-8g/L的酵母抽提物，以为菌株提供氮源和生长因子等。根据本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术的葡萄糖培养基含有A组分和B组分，其中，所述A组分为10-80g/L的葡萄糖和1-3g/L的乙酸，所述B组分为4-6g/L的Na2SO4、35-40g/L的NaCl、20-30g/L的KCl、20-40g/L的NH4Ac、30-40g/L的NaAc和10-30g/L的KAc中的一种或两种。本专利技术中，可以通过本领域常用的各种方式增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白的表达量。例如，可以将插入有表达氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白的核酸的表达载体转化到酵母细胞中，从而增加所述蛋白的表达量。因此，本专利技术对所述酵母细胞没有特别的要求，只要能够表达氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白即可。优选地，所述酵母细胞具有碱基序列如SEQIDNO:2所示的核酸，即，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白的编码核酸的碱基序列如SEQIDNO:2所示。此时，优选使用插入有碱基序列如SEQIDNO:2所示的核酸且具有强启动子的表达载体转化酵母细胞，以增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白的表达量。gccaccatgtccggaaaagcttctacagagggtagcgttactacggagtttctctctgatatcattggtaagacagtgaacgtcaaacttgcctcgggtttactctacagcggaagattggaatccattgatggttttatgaatgttgcactatcgagtgccactgaacactacgagagtaataacaataagcttctaaataagttcaatagtgatgtctttttgaggggcacgcaggtcatgtatatcagtgaacaaaaaatatag(SEQIDNO:2)其中，所述强启动子优选为Padh1启动子、Ppgk启动子或Pfbp启动子。更优选地，所述强启动子为Padh1启动子。其中，所述表达载体可以为插入有碱基序列如SEQIDNO:2所示的核酸并能够使该核酸表达的任何表达载体，例如，质粒或噬菌体。优选地，所述表达载体为在质粒pAUR123的BamH1酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备高抗逆性酵母菌株的方法，其特征在于，该方法包括：在葡萄糖培养基中，增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白的表达量，所述葡萄糖培养基含有葡萄糖和含乙酸根离子源。

【技术特征摘要】
2013.10.29 CN 20131052218581.一种制备酵母菌株的方法，其特征在于，该方法包括：在葡萄糖培养基中培养酵母细胞，所述酵母细胞转化有碱基序列如SEQIDNO:3所示的核酸，所述葡萄糖培养基含有葡萄糖和含乙酸根离子源。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述葡萄糖培养基中，葡萄糖的含量为5-100g/L；以乙酸根的含量计，含乙酸根离子源的含量为0.5-3g/L。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述葡萄糖培养基中，葡萄糖的含量为10-80g/L；以乙酸根的含量计，含乙酸根离子源的含量为2-3g/L。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，含乙酸根离子源为乙酸、乙酸钠、乙酸钾和乙酸铵中的至少一种。5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述葡萄糖培养基还含有氯化物、硫酸盐、糠醛和苯酚中的至少一种。6.根据权利要求1-3中任意一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：高岚，郭勇，刘金胜，刘颖，李宝石，蔺建民，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中国石油化工股份有限公司石油化工科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11