使用共同轻链制备完全人双特异性抗体的方法技术

提供了一种遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠表达特征在于有限数目的轻链可变结构域的免疫球蛋白轻链库。提供了仅表达来自其种系中有限库的一种或少数免疫球蛋白轻链可变结构域的小鼠。提供了使用本文所述的小鼠制备具有包括人轻链可变区的通用轻链的双特异性抗体的方法。提供了制备适合用于多特异性结合蛋白例如双特异性抗体的人可变区的方法和宿主细胞。提供了能够结合第一和第二抗原的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原是单个蛋白的不同表位或两个不同蛋白上的不同表位。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用共同轻链制备完全人双特异性抗体的方法本申请是在2013年6月5日作为PCT国际专利申请提交的，并且要求2012年6月5日提交的美国专利申请No.13/488,628的优先权，所述美国专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。
提供了遗传修饰的小鼠，其表达具有与多样化的人可变区/小鼠恒定区重链结合的共同的人可变区/小鼠恒定区轻链的抗体。提供了制备来自小鼠B细胞的人可变区基因序列的人双特异性抗体的方法。
技术介绍
抗体通常包括同源二聚体重链组分，其中每条重链单体与相同的轻链结合。期望具有异源二聚体重链组分的抗体(例如双特异性抗体)作为治疗性抗体。但是制备具有可以令人满意地结合双特异性抗体的每条重链的适当轻链组分的双特异性抗体已经证明存在问题。在一种方法中，可以通过调查所有轻链可变结构域的使用情况统计信息、鉴定人抗体中最常用的轻链和在体外将该轻链与两条不同特异性的重链进行配对来选择轻链。在另一种方法中，可以通过观测噬菌体展示文库(例如包含人轻链可变区序列的噬菌体展示文库，例如人scFv文库)中的轻链序列和从该文库选择最常使用的轻链可变区来选择轻链。随后可以在两条不同的目的重链上测试轻链。在另一种方法中，可以通过使用两条目的重链的重链可变序列作为探针对轻链可变序列的噬菌体展示文库进行测定来选择轻链。结合两个重链可变序列的轻链可作为所述重链的轻链被选出。在另一种方法中，候选轻链可以与重链的同源轻链进行比对，并对轻链进行修饰以更紧密地匹配两条重链的同源轻链所共有的序列特征。如果免疫原性的可能性需要被最小化，修饰优选地导致存在于已知的人轻链序列中的序列，这样基于本领域已知的用于评估免疫原性的可能性的参数和方法(即，在硅片(insilico)以及湿法检测)，蛋白水解过程不太可能产生T细胞表位。上述所有的方法依赖于包含许多先验约束(例如序列同一性、与特定的预先选定的重链结合的能力等)的体外方法。本领域存在对于不依赖于体外条件下的操作，而相反使用更加生物学合理的方法来制备包含共同轻链的人表位结合蛋白的组合物和方法的需要。专利技术简述提供了遗传修饰的小鼠，其表达人免疫球蛋白重链和轻链可变结构域，其中所述小鼠具有有限的轻链可变库。提供了用于产生与多样化的亲和力成熟的人重链可变结构域库结合并表达的人轻链可变结构域的生物系统。提供了用于制备包含免疫球蛋白可变结构域的结合蛋白的方法，包括用目的抗原免疫具有有限的免疫球蛋白轻链库的小鼠，并且特异性结合将小鼠的免疫球蛋白可变区基因序列用于特异性结合目的抗原的结合蛋白。方法包括制备适合用于制备多特异性抗原结合蛋白的人免疫球蛋白重链可变结构域的方法。提供了遗传工程小鼠，其选择适当的来源于未经重排的人重链可变区基因区段库的亲和力成熟的人免疫球蛋白重链可变结构域，其中亲和力成熟的人重链可变结构域与来源于一种人轻链可变区基因区段的单一人轻链可变结构域结合并表达。还提供了呈现两种人轻链可变区基因区段的选择的遗传工程小鼠。在多个方面，一种或两种基因区段包括人Vκ1-39和人Vκ3-20。提供了遗传工程小鼠，其表达来自有限的人轻链可变区基因区段库的有限的人轻链可变结构域库或单一人轻链可变结构域。将小鼠遗传工程化以包含单一未经重排的人轻链可变区基因区段(或两种人轻链可变区基因区段)，所述基因区段重排以形成表达单一轻链(或表达两种轻链中的任一种或两种)的重排的人轻链可变区基因(或两种重排的轻链可变区基因)。重排的人轻链可变结构域能够与多个经小鼠选择的亲和力成熟的人重链配对，其中重链可变区特异性地结合不同的表位。提供了遗传工程小鼠，其表达来自有限的人轻链可变区序列库的有限的人轻链可变结构域库或单一人轻链可变结构域。将小鼠遗传工程化以包含单一V/J人轻链序列(或两种V/J序列)，所述序列表达单一轻链可变区(或表达两种可变区中的任一种或两种)。包含可变序列的轻链能够与多个经小鼠克隆选择的亲和力成熟的人重链配对，其中重链可变区特异性地结合不同的表位。一方面，提供了遗传修饰的小鼠，其包含单一人免疫球蛋白轻链可变(VL)区基因区段，所述基因区段能够与人J基因区段(选自一个或多个JL区段)重排并且编码人免疫球蛋白轻链的VL结构域。另一方面，小鼠包含不多于两种的人VL基因区段，其中每一种能够与人J基因区段(选自一个或多个JL区段)重排并且编码人免疫球蛋白轻链的VL结构域。在一个实施方式中，单一人VL基因区段可操作地连接至选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5的人JL基因区段，其中所述单一人VL基因区段能够与任何一个或多个的人JL基因区段重排以形成编码轻链可变区基因的序列。在一个实施方式中，遗传修饰的小鼠包含不含有能够重排以形成免疫球蛋白轻链基因的内源小鼠VL基因区段的免疫球蛋白轻链基因座，其中VL基因座包含能够重排以编码轻链基因的VL区的单一的人VL基因区段。在具体的实施方式中，人VL基因区段是人Vκ1-39Jκ5基因区段或人Vκ3-20Jκ1基因区段。在一个实施方式中，遗传修饰的小鼠包含不含有能够重排以形成免疫球蛋白轻链基因的内源小鼠VL基因区段的VL基因座，其中VL基因座包含不多于两个的能够重排以编码轻链基因的VL区的人VL基因区段。在具体的实施方式中，不多于2个的人VL基因区段是人Vκ1-39Jκ5基因区段和人Vκ3-20Jκ1基因区段。一方面，提供了包含编码人免疫球蛋白轻链VL结构域的单一的经重排的(V/J)人免疫球蛋白轻链可变(VL)区(即，VL/JL区)的遗传修饰的小鼠。另一方面，小鼠包含不多于两个的能够编码人免疫球蛋白轻链VL结构域的重排的人VL区。在一个实施方式中，VL区是重排的人Vκ1-39/J序列或重排的人Vκ3-20/J序列。在一个实施方式中，重排的VL/JL序列的人JL区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。在具体的实施方式中，VL区是人Vκ1-39Jκ5序列或人Vκ3-20Jκ1序列。在具体的实施方式中，小鼠具有人Vκ1-39Jκ5序列和人Vκ3-20Jκ1序列两者。在一个实施方式中，人VL基因区段可操作地连接至人或小鼠前导序列。在一个实施方式中，前导序列是小鼠前导序列。在具体实施方式中，小鼠前导序列是小鼠Vκ3-7前导序列。在具体的实施方式中，前导序列可操作地连接至未经重排的人VL基因区段。在具体的实施方式中，前导序列可操作地连接至重排的人VL/JL序列。在一个实施方式中，VL基因区段可操作地连接于免疫球蛋白启动子序列。在一个实施方式中，启动子序列是人启动子序列。在具体的实施方式中，人免疫球蛋白启动子是人Vκ3-15启动子。在具体的实施方式中，启动子可操作地连接至未经重排的人VL基因区段。在具体的实施方式中，启动子可操作地连接至重排的人VL/JL序列。在一个实施方式中，轻链基因座包括前导序列，所述前导序列的5′(相对于VL基因区段的转录方向)侧接人免疫球蛋白启动子，并且3′侧接人VL基因区段，所述人VL基因区段与人J区段重排并编码包含内源小鼠轻链恒定区(CL)的反向嵌合轻链的VL结构域。在具体的实施方式中，VL基因区段在小鼠Vκ基因座上，并且小鼠CL是小鼠Cκ。在一个实施方式中，轻链基因座包括前导序列，所述前导序列的5′(相对于VL基因区段的转录方向)侧接人免疫球蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备双特异性抗原结合蛋白的方法，包括：获得来源于分离自同一或不同的小鼠的两种不同的B细胞的两种不同的人重链可变区基因序列，所述小鼠表达单一人轻链可变结构域和多个人重链可变结构域，和制备双特异性抗原结合蛋白，其具有包含被所述两种人重链可变区基因序列编码的氨基酸序列的两种人重链和包含所述人轻链可变结构域的人轻链。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.05 US 13/488,6281.一种制备双特异性抗原结合蛋白的方法，包括：(a)表达包含可变结构域的第一人免疫球蛋白重链，所述可变结构域由来源于第一遗传工程小鼠的B细胞的第一人免疫球蛋白重链可变区编码，所述第一遗传工程小鼠已用包含第一表位的第一目标抗原免疫，并且所述第一遗传工程小鼠：(i)具有对于可操作地连接至鼠Cκ区的单一的经重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列是纯合或杂合的种系，所述人免疫球蛋白轻链可变区序列是Vκ1-39/Jκ序列；(ii)具有包括未经重排的人VH基因区段、人D基因区段和人JH基因区段的种系，所述未经重排的人VH基因区段可操作地连接至鼠CH区并且包含选自VH2-5、VH3-23和VH3-30的人VH基因区段；和(iii)包含B细胞群，其中所述群中的每个B细胞表达来源于经重排的人Vκ1-39/Jκ序列的人免疫球蛋白轻链可变结构域，并且其中所述B细胞群包含至少一个表达来源于选自VH2-5、VH3-23和VH3-30的人VH基因区段的人免疫球蛋白重链可变结构域的B细胞；(b)表达包含可变结构域的第二人免疫球蛋白重链，所述可变结构域由来源于第二遗传工程小鼠的B细胞的第二人免疫球蛋白重链可变区编码，所述第二遗传工程小鼠已用包含第二表位的第二目标抗原免疫，并且所述第二遗传工程小鼠：(i)具有对于可操作地连接至鼠Cκ区的单一的经重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列是纯合或杂合的种系，所述人免疫球蛋白轻链可变区序列是Vκ1-39/Jκ序列；(ii)具有包括未经重排的人VH基因区段、人D基因区段和人JH基因区段的种系，所述未经重排的人VH基因区段可操作地连接至鼠CH区并且包含选自VH2-5、VH3-23和VH3-30的人VH基因区段；和(iii)包含B细胞群，其中所述群中的每个B细胞表达来源于经重排的人Vκ1-39/Jκ序列的人免疫球蛋白轻链可变结构域，并且所述B细胞群包含至少一个表达来源于选自VH2-5、VH3-23和VH3-30的人VH基因区段的人免疫球蛋白重链可变结构域的B细胞；以及(c)将所表达的包含由第一人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域的第一人免疫球蛋白重链与人免疫球蛋白轻链配对以及与所表达的同样与所述人免疫球蛋白轻链配对的第二人免疫球蛋白重链配对，所述第二人免疫球蛋白重链包含由第二人免疫球蛋白重链可变区编码的可变结构域，从而制备双特异性抗原结合蛋白。2.权利要求1所述的方法，其中所述第一遗传工程小鼠和第二遗传工程小鼠是同一小鼠或不同小鼠。3.权利要求2所述的方法，其中所述同一或不同小鼠不含有能够重排以形成编码免疫球蛋白轻链可变结构域的基因的内源免疫球蛋白轻链可变基因区段。4.权利要求1所述的方法，其中所述第一目标抗原和第二目标抗原是：两种不同的抗原；或同一抗原并且所述第一和第二人免疫球蛋白重链结合所述同一抗原的两种不同表位。5.权利要求1所述的方法，其中：所述第一遗传工程小鼠的种系包括人VH基因区段VH2-5并且所述第二遗传工程小鼠的种系包括人VH基因区段VH3-30；或所述第一遗传工程小鼠的种系包括人VH基...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·巴布，J·麦克维尔特，L·麦克唐纳，S·史蒂文斯，S·戴维斯，D·R·巴克勒，K·A·霍西阿瓦，A·J·墨菲，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US