新型硝基还原酶底物制造技术

本发明专利技术涉及一种下式(I)的用于检测硝基还原酶活性的酶底物：其中：·X为NX1-CO；·R1不存在或者为选自Cl、CH3、Br、F、I、烷基、芳基和羧基的取代基；·R2不存在或者为选自Cl、O-CH2-O、O-CH3、F、二亚乙基二胺-CH3、NR3R4、Br、I、烷基、芳基、羧基、NO2和的取代基；·R3和R4独立地为H或者含有1-4个碳原子的烷基；·X1选自H、CH3、C2H4Ph、OH、烷基和芳基。

【技术实现步骤摘要】
新型硝基还原酶底物本申请是申请号为200880018139.1申请日为2008年5月29日的中国专利申请的分案申请。本专利技术涉及用于检测硝基还原酶活性的新型酶底物。这些底物可用于包括产生物理化学信号的酶水解步骤的应用，尤其用于微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等中。当前存在非常多的检测微生物的介质。该检测可以尤其基于使用特别的底物，所述底物对需要检测的微生物酶具有特异性。通常而言，合成的酶底物由对待发现的酶活性具有特异性的第一部分和用作标签(通常为发色或荧光标记)的第二部分。因此，在细菌的情况下，取决于是否有反应来选择底物，可以表征微生物的性质。硝基还原酶活性可以尤其用于发现一组、一种或一类细菌。还可以用于监控微生物的还原新陈代谢，例如与其生长或抑制该生长相关的还原新陈代谢。某些细菌还原硝基芳族化合物的能力为人所知已经许多年。Asnis(1957)报导了由大肠杆菌萃取物中分离能够还原对硝基苯甲酸的黄素蛋白。自从该报导之后，在多种生物体中已经鉴别出硝基芳基还原酶活性。这包括严格的需氧微生物，例如假单胞菌(Won等，1974)和诺卡氏菌(Villanueva，1964)，严格的厌氧微生物，例如梭菌(Ancermaier和Simon，1983)和韦荣氏球菌(McCormick等，1976)，或者真菌类(Masuda和Ozaki，1993)以及真核寄生虫(Douch，1975)。存在着据认为能够通过细菌硝基芳基还原酶而被还原的大范围的底物。它们尤其为硝基芳族化合物，例如对硝基苯甲酸、对硝基苯酚、对硝基苯胺及2,4,6-三硝基甲苯(McCormick等，1976)。通常而言，硝基还原酶的酶活性的检测是通过间接的方法，例如通过监控底物或辅助因子的消失而进行。例如，Kitamura等(1983)研究了对硝基苯甲酸甲酯及一系列其他的硝基芳族化合物与大肠杆菌萃取物的还原。然而，该方法并不非常灵敏且不适合用于在多相介质中进行检测。还可以提及申请WO00/28073，其描述了基于硝基香豆素的荧光底物用于直接检测硝基芳基还原酶的活性。该类硝基芳族化合物能够在还原后形成高度荧光的化合物，因而易于被检测。然而，该底物并不适合用于在多相介质中的检测。因而，本专利技术建议改进用于检测微生物的硝基还原酶底物。与现有的底物相比，这些新型的底物易于合成且由于其形成一种不在反应介质中扩散的颜色而可以尤其用于在胶体介质中以检测微生物。在对本专利技术进行描述之前，给出如下定义以便于本专利技术的公开。术语“酶底物”用于指可以通过酶进行水解以形成产物，从而允许微生物细胞或细胞器的直接或间接检测的底物。在硝基还原酶底物的情况下，该底物尤其包含硝酸盐官能团，其通过待发现的酶活性而被部分或全部还原，该硝基官能团的还原改变使分子的某些物理化学性质，使该还原反应得以跟踪。本专利技术的底物尤其适用于流式细胞术(flowcytometry)，这是因为还原产物主要保留在表达酶活性的细胞中，所以可以具体数出表达该活性的细胞或甚至将其与其他样品分开。本专利技术的底物还适用于组织酶学，这是因为还原产物主要保留在还原点上，所以可以具体识别出在组织中表达该活性的细胞或细胞器。由于其具有低毒性，本专利技术的底物适于检测细胞培养硝基还原酶活性。本专利技术的底物还非常适合用于检测和/或识别介质中，这是因为它们形成在反应介质中不扩散的颜色或荧光。在本申请中，术语“颜色”包括可见光谱中的颜色，其吸收可见光谱中的光或荧光，其在一个波长(λex)吸收且在较高的波长(λem)发光。本专利技术的底物可以成盐，即呈诸如为氯化物、溴化物、钾盐或三氟乙酸盐的盐的形式。术语“硝基还原酶”用于指可以完全或部分还原NO2基团的酶。术语“烷基”用于指基于饱和烃基团的链，尤其例如C1-C6烷基，即含有1-6个碳原子的直链或支链烷基。例如可以提及甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、异戊基及己基。术语“芳基”用于指由芳环衍生的官能团(或取代基)，例如C6-C10芳环，尤其为苯基、苄基、1-萘基或2-萘基。术语“羧基”用于尤其指由经由一个双键而与第一个氧原子连接且经由一个单键而与第二个氧原子相连的碳原子组成的官能团，其中所述第二个氧原子为电负性或者与氢原子相连接。取决于分子的pKa以及介质的pH，所述羧基可以呈离子化的形式，即第二个氧原子未连接H，则其为电负性。术语“反应介质”用于指包含表达细胞或细胞器的新陈代谢和/或微生物生长所需所有成分的介质。该反应介质可以用于流式细胞术、组织酶学、细胞培养等，或者用作微生物检测和/或识别介质。所述反应介质可以为固体、半固体或液体。术语“固体介质”用于例如指凝胶化的介质。琼脂在微生物学中为用于培养微生物的常规凝胶剂，但是可以使用明胶或琼脂糖。有些制品是可商购获得的，例如哥伦比亚琼脂、胰酪蛋白胨大豆琼脂、麦康基琼脂、沙鲍洛琼脂，或者更通常而言描述于MicrobiologicalMedia(CRCPress)手册中的那些。反应介质可以包含一种成分或多种组合成分，例如氨基酸类、蛋白胨、烃、核苷酸、矿物质、维生素、抗体、表面活性剂、缓冲溶液、磷酸盐、铵盐、钠盐或金属盐类。所述介质还可以包含着色剂。例如作为着色剂可以提及伊文思蓝、中性红、羊血、马血、遮光剂例如氧化钛、硝基苯胺、孔雀绿、亮绿等。所述反应介质可以为“检测和/或识别介质”，即显影介质或培养及显影介质。在第一种情况下，在接种之前培养微生物，并且在第二种情况下，检测和/或识别介质还构成培养介质。术语“生物样品”用于指由生物流体试样衍生的临床样品，或者由任何类型食品衍生的食品样品。该样品因此可以为液体或者固体，而且可以没有限制性地提及血液、血浆、尿液或粪便的临床样品，或者来自鼻子、喉咙、皮肤、伤口或脑脊髓液的试样，来自水或诸如奶或果汁的饮料、酸奶、肉类、蛋类、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼类等的食品样品，或者由动物饲料例如尤其由动物饮食而衍生的食品样品。所述样品还可以为来自临床环境的试样、家畜试样、来自食品、化妆品或医药产品的试样。术语“环境试样”用于尤其指由表面、液体、原料或由产物提取的试样。在本专利技术中，术语“微生物”涵盖细菌、尤其为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、酵母、寄生虫、真菌，并且更通常而言为通常为单细胞、人眼看不见且可以在实验室复制且操作的生物体。作为革兰氏阴性菌，可以提及如下属的细菌：假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷白氏杆菌(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、摩根(氏)菌属(Morganella)、弧菌(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、伯克氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、气单胞菌属(Aeromona本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含至少一种具有下式(I)的用于检测硝基还原酶活性的酶底物的微生物检测和/或识别介质：其中：·X为NX1‑CO；·R1不存在或者为选自Cl、CH3、Br、F、I、烷基、芳基和羧基的取代基；·R2不存在或者为选自Cl、O‑CH2‑O、O‑CH3、F、二亚乙基二胺‑CH3、NR3R4、Br、I、烷基、芳基、羧基、NO2和的取代基；·R3和R4独立地为H或者含有1‑4个碳原子的烷基；·X1选自H、CH3、C2H4Ph、OH、烷基和芳基。

【技术特征摘要】
2007.05.31 FR 07553731.一种包含至少一种具有下式(I)的用于检测硝基还原酶活性的酶底物的微生物检测和/或识别介质：其中：·X为NX1-CO；·R1不存在或者为选自Cl、CH3、Br、F、I、烷基、芳基和羧基的取代基；·R2不存在或者为选自Cl、O-CH2-O、O-CH3、F、二亚乙基二胺-CH3、NR3R4、Br、I、烷基、芳基、羧基、NO2和的取代基；·R3和R4独立地为H或者含有1-4个碳原子的烷基；·X1选自H、CH3、C2H4Ph、OH、烷基和芳基。2.权利要求1所述的微...

【专利技术属性】
技术研发人员：O·法布雷加，A·詹姆斯，V·L·萨尔瓦图拉，S·欧伦加，S·斯坦福斯，
申请(专利权)人：生物梅里埃公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR