一种检测表皮葡萄球菌的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测表皮葡萄球菌的试剂盒及其应用，属于基因检测技术领域。本发明专利技术的试剂盒采用SEQ ID NO.1-2所述的引物对待测样品进行PCR扩增，将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，若在190bp处有单一条带，则结果为阳性，否则为阴性。本发明专利技术引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为表皮葡萄球菌的检测提供了新的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种检测表皮葡萄球菌的试剂盒及其应用
本专利技术涉及基因检测
，具体地说涉及用于检测表皮葡萄球菌的试剂盒及其应用。
技术介绍
表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidemidis)是滋生于生物体表皮上的一种常见细菌。在人体的皮肤、阴道等部位寄生，属于正常菌群类型。葡萄球菌为革兰氏阳性菌，属细球菌科，葡萄球菌属。在其衰老、死亡或被白细胞吞噬后，或是某些耐药菌株可被染成革兰氏阴性。表皮葡萄球菌在自然界中广泛分布，多数为非致病菌，仅少数可导致人和动物的化脓性感染。葡萄球菌是最常见的化脓性球菌，是引起医院内交叉感染的重要来源。表皮葡萄球菌主要引起痈、疖、肺炎、毛囊炎、化脓性骨髓炎、脑脓肿、肝脓肿及伤口感染等。其致病性随细菌传播方式、菌液浓度、毒性以及自身免疫力差异而不同。近年来，由于抗生素的滥用，导致耐药菌株逐年递增，已有研究报道，表皮葡萄球菌对青霉素的耐药率高达90％。在不明病原菌的情况下滥用药物，针对性不强，效果差，破坏患者自身免疫力，还会增强菌株的耐药性。因此，临床上迫切需要一种快速、准确的体外检测手段辨识菌种类型，进行有针对性的个体化治疗。传统的细菌检验方法主要通过涂片镜检和分离培养的方法对细菌生理化特征进行分类。涂片镜检的方法需要有丰富经验的技术工作者根据细菌形态、排列方式和染色性作出初步诊断，分离培养需要较长的时间才能进行结果判读，不利于及时诊断病原。患者有病情恶化蔓延的风险。PCR(聚合酶链式反应)技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它是生物体外的特殊DNA复制，将微量的DNA大幅度增加。PCR检测方法具有操作简便、快捷、稳定、灵敏度高、特异性强等特点，已逐步成为细菌的主流快速体外检测方法。传统的表皮葡萄球菌PCR检测方法具有耗时长、检出率低、准确性低和重复性差的缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测表皮葡萄球菌的试剂盒及其应用。本专利技术首先提供用于检测表皮葡萄球菌的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示。本专利技术提供了上述引物对在检测表皮葡萄球菌中的应用。本专利技术提供了上述引物对在制备表皮葡萄球菌检测试剂盒中的应用。本专利技术还提供了上述引物对在制备表皮葡萄球菌诊断试剂中的应用。含有本专利技术引物对的试剂盒也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本专利技术的引物，根据需要该引物可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外，本专利技术的试剂盒中还可以包括用于PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本专利技术所需要的其它成分及用具。进一步地，本专利技术的试剂盒其25μL工作体系为：本专利技术试剂盒的工作程序为：预变性95℃、5min；再经95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；最后72℃延伸7min。本专利技术的试剂盒，其工作程序还包括将PCR产物用2％-3％琼脂糖凝胶进行电泳。本专利技术还提供了一种检测表皮葡萄球菌的方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后根据电泳条带判定结果。若在190bp处有单一条带，则结果为阳性，否则为阴性。本专利技术引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，重复性好，易于判读，为表皮葡萄球菌的检测提供了新的方法。本专利技术建立的检测方法可用于表皮葡萄球菌快速体外诊断和流行病学调查提供技术支持。附图说明图1为本专利技术PCR反应体系优化试验凝胶电泳结果图；其中，泳道1、6、11为无菌水空白对照，泳道2、7、12为对照人基因组DNA阴性对照，泳道3、8、13为表皮葡萄球菌106cfu/mL浓度的DNA阳性对照，泳道4、9、14为大肠杆菌模板DNA样品，泳道5、10、15为表皮葡萄球菌模板DNA样品，M为GeneRuler100bpLadder。泳道1-5为上、下游引物各加1.5μL，泳道6-10为上、下游引物各加0.5μL，泳道11-15为上、下游引物各加1μL。图2为本专利技术PCR反应程序优化试验凝胶电泳结果图；其中，泳道1、6、11为无菌水空白对照，泳道2、7、12为对照人基因组DNA阴性对照，泳道3、8、13为表皮葡萄球菌106cfu/mL浓度的DNA阳性对照，泳道4、9、14为大肠杆菌模板DNA样品，泳道5、10、15为表皮葡萄球菌模板DNA样品，M为GeneRuler100bpLadder。泳道1-5为PCR反应退火温度55℃，泳道6-10为PCR反应退火温度60℃，泳道11-15为PCR反应退火温度65℃。图3为本专利技术特异性评估实验凝胶电泳结果图；其中，泳道1-11分别为：无菌水空白对照，人基因组DNA、屎肠球菌、粪肠球菌、金黄葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌和绿脓杆菌，M为GeneRuler100bpLadder。图4为本专利技术灵敏度评估实验凝胶电泳结果图；其中，泳道1为无菌水空白对照，2-8分别为表皮葡萄球菌初始模板DNA样品的106、105、104、103、102、10、1cfu/mL稀释液，M为GeneRuler100bpLadder。图5为本专利技术临床样品评估实验凝胶电泳结果图，其中，泳道1为无菌水空白对照，泳道2-5、7-10分别为8株疑似菌株模板，泳道6为表皮葡萄球菌阳性对照，M为GeneRuler100bpLadder。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHaborLaboratoryPress,1989)中所述的条件或按照制造厂商所提供的条件进行。实施例1引物的设计本专利技术提供的检测引物的核苷酸序列：正向引物F：5’-GTTGCGGAATCATGGTACTGT-3’；反向引物R：5’-AGACAGTTACTCTCACAGGCA-3’。实施例2PCR检测方法的建立1、提取模板DNA煮沸法提取模板DNA:取1mL浓度为106个麦氏单位的表皮葡萄球菌菌液置于1.5mL无菌离心管中；室温10000rpm离心3min，弃上清，加入80μL的细胞裂解液(1％Triton,10mMTris-HCL,1mMpH值8.0的EDTA)，煮沸6min，再室温10000rpm离心3min，取上清放置4℃备用或-20℃储存。2、PCR反应体系优化试验(25μL)体系一：体系二：体系三：由图1可知，反应体系一中上、下游引物各加1.5μL(终浓度为0.6μM)时大肠杆菌模板DNA样品出现假阳性。反应体系二中上、下游引物各加0.5μL(终浓度为0.2μM)时表皮葡萄球菌模板DNA样品条带较弱，反应体系三上、下游引物各加1μL(终浓度为0.4μM)时表皮葡萄球菌模板DNA样品条带较亮，故最终确定本专利技术PCR反应体系中上、下游引物各加1μL。3、PCR反应条件优化试验预变性95℃、5min；再经95℃变性30s，分本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测表皮葡萄球菌的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示的引物对。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其25μLPCR反应体系为：3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为：预变性95℃、5min；再经95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；最后72℃延伸...

【专利技术属性】
技术研发人员：何犇，易翔，及思莹，黄茜，杨君，
申请(专利权)人：中生北控生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11