本发明专利技术涉及一种利用肠杆菌生产耐低温β-甘露聚糖酶的方法，该方法是将肠杆菌(Enterobacter sp.N18)接种于含有碳源、氮源的培养基中，37℃，培养12～96h，所得发酵液即为β-甘露聚糖酶产品。与现有技术相比，本发明专利技术利用自然筛选到的天然肠杆菌进行发酵培养，即可得到β-甘露聚糖酶，成本低，操作简单。本发明专利技术所得β-甘露聚糖酶酶活高、稳定性好，在0～100℃、pH 3.0～11.0、盐浓度0～4.5M范围内均能保有活性20℃下比活可达5484U/mg。此外，该酶可使粘度超过800mPa·s的瓜尔胶溶液在10min内粘度降低95％以上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生产β-甘露聚糖酶的方法，具体涉及利用肠杆菌发酵培养生产耐低温β-甘露聚糖酶的方法。
技术介绍
半纤维素是地球上第二大资源，甘露聚糖作为半纤维素的一个主要组成部分有着极大的开发价值。甘露聚糖资源的开发和利用需要用到甘露聚糖酶。随着人们对甘露聚糖资源的开发，β-甘露聚糖酶在食品、医药、造纸、饲料、纺织印染、石油开采等工业领域都有着广泛的发展空间。β-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mananmannohydrolase；EC 3.2.1.78)能够水解含有β-1，4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖(包括甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等)。β-甘露聚糖酶来源广泛，包括动物、植物、细菌、放线菌、真菌等，其中又主要以微生物来源为主。虽然β-甘露聚糖酶的需求量不断增大，但是实际上它在各行业中的应用现状与其重要性相差甚远。原因在于微生物生产β-甘露聚糖酶的产量较低、酶活性较小、强制生产无疑导致生产成本过高。所以降低β-甘露聚糖酶的生产成本、提高酶的活性是使β-甘露聚糖酶能够得到大规模应用的前提。目前，国内外关于利用微生物生产β-甘露聚糖酶的报道很多，包括枯草芽孢杆菌、黑曲霉、地衣芽孢杆菌、毛壳菌等等，但是这些菌的野生菌株产β-甘露聚糖酶的活性普遍较低。短小芽孢杆菌XZG33产β-甘露聚糖酶粗酶液比活仅达到46.3U/mg(以刺槐豆胶为底物)，且培养基中需分别加入1％(wt％)的蛋白胨和酵母粉，大大提高了成本，经纯化后比活方可达到1838.2U/mg，但酶活依然较低，且纯化处理的成本过高(高兆建，唐仕荣，孙会刚，et al.短小芽孢杆菌XZG33耐高温酸性β-甘露聚糖酶酶学性质研究[J].安徽农业科学，2010，38(18)：9396-9399)。中国专利技术专利CN 102732494A公开了一种将毛壳菌产甘露聚糖酶的基因在毕赤酵母中高效表达的方法，但其在5L发酵罐中发酵，产酶比活才能达到8201U/mg(以刺槐豆胶为底物)，此外，由于发酵时需要采用毕赤酵母专用培养基BMGY(包含质量分数为1％的酵母粉，2％的蛋白胨，1.34％的YNB，微量元素以及1％的甘油)，成分复杂，成本高。中国专利技术专利CN 102433267A中也公开了一种利用重组酵母发酵产β-甘露聚糖酶的方法，在高成本的BMGY培养基下发酵，诱导时间长达84小时时酶活方能达到6336U/mL(以槐豆胶为底物)。中国专利技术专利CN101016531 A中公开了一种中性β-甘露聚糖酶的生产方法，其利用枯草芽孢杆菌TQS6发酵产β-甘露聚糖酶，发酵液中酵母膏和蛋白胨的需求量同样高达10g/L，此外仍需加入魔芋降解液、豆粕粉、玉米渣等多种碳源，连续发酵后酶活才能达到1500-1600U/mL(以魔芋粉为底物)。另一方面，如今大多数已报道的微生物产β-甘露聚糖酶多为中温酶，最适温度范围较窄，尤其在低温领域，关于耐低温β-甘露聚糖酶的报道仅有5篇。这5种β-甘露聚糖酶分别来源于黑曲霉(Aspergillus niger)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，黄杆菌(Flavobacterium sp.)，鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)以及一种南极跳虫(Cryptopygus antarcticus)。但它们所产的酶经纯化后在20℃下以刺槐豆胶为底物检测，比活仅分别为398.7U/mg，74.5U/mg，1.5U/mg，69.4U/mg和416.3U/mg。本专利技术提供了一种利用肠杆菌生产耐低温β-甘露聚糖酶的方法，克服了现有技术生产β-甘露聚糖酶比活低、纯化成本高、低温活性差等缺陷。仅利用摇瓶培养其酶活可达7260U(以刺槐豆胶为底物)，培养基成分简单，成本低，且该酶能在10min内将粘度超过800mPa·s的1.4％的瓜尔胶溶液粘度降低95％以上，降粘效率高。该酶的最适反应条件为50℃，pH7.5，但在0～100℃，pH3.0～11.0，NaCl含量0～4.5M范围内均保有活性，20℃下比活依然保持在50％以上。目前，未见关于肠杆菌生产β-甘露聚糖酶的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种比活高、纯化成本低、低温活性高的利用肠杆菌生产耐低温β-甘露聚糖酶的方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种利用肠杆菌生产耐低温β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于，该方法是将肠杆菌(Enterobacter sp.N18)接种于含有碳源、氮源的培养基中，37℃，培养12～96h，所得发酵液即为β-甘露聚糖酶产品。肠杆菌(Enterobacter sp.N18)已经在非专利文献中公开了，已经于2014-11-14公开发表在《European Journal of Lipid Science and Technology》，可以通过以下网址查询：http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ejlt.201400386/pdf。公众可以向申请人提出申请从而获得该生物材料，附件为申请人提供的保证从申请日起二十年内向公众发放生物材料的证明。所述的含有碳源、氮源的培养基包括：碳源0.1～3wt％，氮源0.05～0.5wt％，KH2PO40.245wt％，Na2HPO4·12H2O 1.0wt％，MgSO4 0.01wt％，酵母粉0.05wt％，MnSO4·H2O0.03wt％，Na2MoO4·2H2O 0.01wt％，FeSO4·7H2O 0.2wt％，CuSO4 0.006wt％，CaCl2 0.1wt％。所述的碳源包括瓜尔胶、魔芋粉、槐豆胶、D-甘露糖、D-半乳糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉或糊精。所述的碳源为魔芋粉，质量百分含量为1～2.0％。所述的氮源包括NH4NO3、蛋白胨、酵母粉、尿素、NaNO3或NH4Cl。所述的氮源为NH4NO3，质量浓度为0.1～0.2％。所述的β-甘露聚糖酶在0～100℃，pH 3.0～11.0，NaCl浓度0-4.5M环境下使用。所述的β-甘露聚糖酶在50℃，pH 7.5下使用。培养所得发酵液直接使用，或经提纯后使用。所述的β-甘露聚糖酶用于油田压裂开发中压裂液的破胶、降粘，瓜尔胶、魔芋胶、刺槐豆胶等的水解。本专利技术提供了一种利用肠杆菌生产β-甘露聚糖酶的方法，培养获得β-甘露聚糖酶(粗酶液)酶活可达7260U(以刺槐豆胶为底物)，本专利技术所得酶能在10min内将1.4％的瓜尔胶溶液粘度由800m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用肠杆菌生产耐低温β‑甘露聚糖酶的方法，其特征在于，该方法是将肠杆菌(Enterobacter sp.N18)接种于含有碳源、氮源的培养基中，37℃，培养12～96h，所得发酵液即为β‑甘露聚糖酶产品。
【技术特征摘要】
1.一种利用肠杆菌生产耐低温β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于，该方法是
将肠杆菌(Enterobacter sp.N18)接种于含有碳源、氮源的培养基中，37℃，培养12～96h，
所得发酵液即为β-甘露聚糖酶产品。
2.根据权利要求1所述的一种利用肠杆菌生产耐低温β-甘露聚糖酶的方法，
其特征在于，所述的含有碳源、氮源的培养基包括：碳源0.1～3wt％，氮源0.05～0.5wt％，
KH2PO40.245wt％，Na2HPO4·12H2O1.0wt％，MgSO40.01wt％，酵母粉0.05wt％，MnSO4·H2O0.03wt％，Na2MoO4·2H2O0.01wt％，FeSO4·7H2O0.2wt％，CuSO40.006wt％，CaCl20.1wt％。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用肠杆菌生产耐低温β-甘露聚糖酶的方
法，其特征在于，所述的碳源包括瓜尔胶、魔芋粉、槐豆胶、D-甘露糖、D-半乳糖、麦
芽糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉或糊精。
4.根据权利要求3所述的一种利用肠杆菌生产耐低温β-甘露聚糖酶的方法，
其特征在于，所述的碳源为魔芋粉，质量百分含量为...
【专利技术属性】
技术研发人员：牟伯中，杨世忠，刘金峰，刚洪泽，尤佳，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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