本发明专利技术属于猪的转基因技术领域，具体涉及一种利用过表达HOXA10基因制备转基因猪的方法。本发明专利技术的特征在于，将构建的HOXA10基因表达载体通过脂质体转染和硫酸盐(G418)筛选得到稳定表达的转HOXA10基因的细胞系；以转HOXA10基因的猪成纤维细胞为核供体通过人工核移植的方法移入去核的猪的卵母细胞中形成重构胚；将重构胚胎移植入受体母猪输卵管中，待母猪生产获得转HOXA10基因猪并进行分子鉴定，筛选出阳性转HOXA10基因猪。本发明专利技术的转基因猪不仅为研究HOXA10基因提高繁殖力的机理提供素材，也为揭示猪HOXA10基因其他功能提供了动物模型。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于猪转基因
，具体涉及一种利用过表达H0XA10基因制备转基 因猪的方法。
技术介绍
养猪业是畜牧业生产体系的重要组成部分，在畜牧行业中占有举足轻重的地位。 对于养猪生产者来说，猪繁殖性状特别是产仔数是影响生产效益的重要因素之一。但由于 产仔数性状受到受精率、排卵率、胚胎着床等多种因素的影响，同时还是低遗传力性状，遗 传力仅为0. 10-0. 15,通过传统的选育方法进行改良，进展缓慢、收效甚微。虽然产仔数遗传 改良难度大，但因其经济效益高，开发利用新的遗传改良技术尤为重要。 从上世纪80年代起，转基因技术发展迅速。在生物育种方面，相对于传统技术， 使用转基因技术可使育种年限大大缩短。因此，转基因技术为提高母猪繁殖性能与遗传改 良提供了新思路以及新途径。但在利用转基因技术提高母猪繁殖数性能的过程中，选择影 响母猪繁殖性能的主效基因是最为关键的一环，因此对所选基因的功能鉴定则显得十分重 要。 在人与小鼠中，同源异形框基因H0XA10 (HomoboxlO)已被多次报道与子 宫内膜容受性（TaylorHSetal.，HOXgeneexpressionisalteredinthe endometriumofwomenwithendometriosis.Hum.Reprod1999,14(5):1328-1331 ； BagotCNetal.,:MaternalHoxalOisrequiredforpinopodformationin thedevelopmentofmouseuterinereceptivitytoembryoimplantation. DevelopmentalDynamics2001，222，（3) :538-544)、胚胎附植(TaylorHS:Therole ofHOXgenesinhumanimplantation.Hum.Reprod, 2000, 6(1) :75-79：HyuniungLim etal. ,Hoxa-10RegulatesUterineStromalCellResponsivenesstoProgesterone duringImplantationandDecidualizationintheMouse.MolecularEndocrinology June1999, 13 (6): 1005-1017)和胚胎发育（LeoFetal.，：Regulationoftryptophan 2,3-dioxygenasebyHOXA10enhancesembryoviabilitythroughserotonin signaling.EndocrinologyandMetabolim2011，300(1) :86_93)等繁殖性状相关D 本 实验室对该基因的部分功能进行了相关研究，发现H0XA10基因在猪（Genebank登录号为 JN836599)与人（GenBank登录号为NM_018951)和小鼠（GenBank登录号为NM_008263)中 高度保守，并且猪H0XA10基因的表达与母猪子宫内膜的功能相关；同时通过孕激素处理 妊娠小鼠，发现H0XA10基因表达量上调时，小鼠的胚胎着床数上升，验证了H0XA10基因对 胎附植具有重要作用（WuDetal. ,Molecularcharacterizationandidentification oftheE2/P4responseelementintheporcineHOXAlOgene.MolCellBiochem 2013, 374:213-222)。因而，猪H0XA10作为与繁殖性状密切相关的候选基因，构建转H0XA10 基因猪模型，从个体水平上进一步研究其作用机理并用于提高猪繁殖性能显得十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用过表达H0XA10基因制备 转基猪的方法。本专利技术以猪H0XA10基因为研宄对象，基于传统克隆技术，利用本实验前期 构建的雌激素诱导型启动子载体质粒pc3. 1-H0XA10-DNA转染大白猪胎儿成纤维细胞，通 过G418筛选，PCR鉴定转H0XA10基因细胞系，然后将所建立的PCR阳性转H0XA10基因细胞 系用于手工核移植，共移植5头受体母猪，其中3头受孕，最后通过PCR、RT-PCR、染色体步 移技术检测H0XA10基因的表达证实获得H0XA10的转基因克隆猪。该转基因猪可用于研宄 H0XA10对母猪繁殖性能的影响并提供动物模型，以及培育具有高繁殖性能的优良品种猪。 本专利技术的技术方案如下所述： 1、构建稳定表达H0XA10基因的猪成纤维细胞系： 1. 1线性化pc3. 1-H0XA10-DNA载体：将本申请人所在的华中农业大学动物遗传育 种与繁殖实验室前期已构建的pc3. 1-H0XA10-DNA质粒（见序列表SEQIDNO:l、图1)DNA 采用Bglll单酶切进行线性化处理。 1. 2建立大白猪胎儿成纤维细胞系：采用胰酶消化法消化33日龄的大白猪胎儿， 分离得到的大白猪胎儿成纤维细胞置于细胞液中在38. 5°C、5%C02、100%湿度的培养箱中 进行传代培养。 1.3建立转H0XA10基因细胞系：利用Y染色体特异基因SRY序列（Genebank 登录号：U49860)设计引物来鉴定大白猪胎儿成纤维细胞的性别，根据实验需求选取不 同性别的大白猪胎儿成纤维细胞作为受体细胞，利用Invitrogen公司生产的脂质体 Lipofectamine?2000(货号：11668-019)将pc3. 1-H0XA10-DNA质粒转染入受体细胞。转 染24小时后利用800yg/mlG418进行筛选。连续筛选7-8天后将G418浓度逐渐降低至 200yg/ml并维持培养，最终获得抗性单克隆细胞并扩大培养。随后通过PCR对获得的单克 隆细胞进行鉴定，得到转H0XA10基因的阳性细胞，用于后续实验。 2、转H0XA10基因克隆胚胎的制备 2. 1猪卵母细胞体外成熟培养：从屠宰场收集猪的卵巢置于37°C生理盐水中，2小 时内运回实验室。采用带有18号针头的10ml-次性注射器采集3-6_卵泡中的卵泡液并 放入15ml离心管中，静止10分钟后弃去上清，用采卵液（名称PVA-TL-HEPES，配方：称取聚 乙烯醇 0?lg，NaCl6. 6633g，KCl0? 2386g，NaH2P040. 0408g，NaHC030. 168g，羟乙基哌嗪乙硫 磺酸Ifepes2. 383g，酚红0. 0022g，山梨醣醇2. 186g，丙酮酸钠0. 022g，乳酸钠1. 868ml，青 霉素GO. 065g，硫酸链霉素 0? 025g，MgCl2 ? 6H20 0? 1017g，CaCl2 ? 2H200. 294g，用双蒸水定 容至100ml，并将pH调至7. 4)洗两遍。在显微镜下挑选形态规则，细胞质均匀，外围有3-5 层卵丘细胞紧密包裹的卵丘细胞-卵母细胞复合体（简称COCs)置于38. 5°C、5%C02、饱和 湿度的培养箱中培养42-44小时，随后用透明质酸酶消化，吹打成裸卵，以第一极体排出为 猪卵母细胞成熟的标准。猪卵母细胞成熟本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用过表达HOXA10基因制备转基因猪的方法，其特征在于下列步骤：(1)线性化pc3.1‑HOXA10‑DNA载体：将已雌激素诱导型HOXA10基因表达载体pc3.1‑HOXA10‑DNA载体用BglII进行单酶切线性化处理，分离纯化得到线性表达盒片段，该表达盒片段的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；(2)构建大白猪胎儿成纤维细胞系：采用胰酶消化法消化33日龄的大白猪胎儿，分离得到的大白猪胎儿成纤维细胞置于细胞液中，在38.5℃、5％CO2、100％湿度的培养箱中进行传代培养；(3)脂质体转染及细胞筛选：利用脂质体将HOXA10基因表达载体转染入受体细胞，采用800μg/mlG418连续筛选7‑8天后，将G418浓度逐渐降低至200μg/ml并维持培养，最终获得抗性单克隆细胞并扩大培养，随后通过PCR对获得的单克隆细胞进行鉴定，得到表达插入的HOXA10基因的阳性细胞；(4)利用人工克隆方法获得重组胚胎：1)卵母细胞的制备：从屠宰场收集的猪的卵巢置于37℃生理盐水中，2小时内运回实验室，采用带有18号针头的10ml一次性注射器采集3‑6mm卵泡中的卵泡液，将采集好的卵泡液放入15ml离心管中，静止10分钟后弃去上清，用采卵液清洗两遍，在显微镜下挑选形态规则，细胞质均匀，外围有3‑5层卵丘细胞紧密包裹的卵丘细胞‑卵母细胞复合体置于38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养42‑44小时后用透明质酸酶消化，吹打成裸卵，以第一极体排出为卵母细胞成熟的标准；2)构建重构胚胎：将成熟的卵母细胞置于显微操作盘工作滴中，随后将固定针固定住卵母细胞，将注射针针口正对极体且位于透明带间隙内，缓缓吸取1/5‑1/4的细胞质并同时吸走极体，去除卵母细胞的细胞核，然后选取中等大小、活力较好的细胞注入卵母细胞卵周隙，最后采用电融合的方法形成重构胚胎，融合电击参数为1.3kv/mm、30us、2次脉冲，30min后观察融合率，未融合的进行二次融合，将融合后的卵母细胞放入38℃、5％CO2中培养，48h后观察卵裂率，6d后观察囊胚发育情况；3)胚胎移植：当重组胚胎体发育至2‑4细胞期后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，每头受体移植约250枚胚胎，共移植5头母猪，胚胎移植后35天、70天时进行B超妊娠检测；4)转基因猪的鉴定：小猪出生后采取耳朵与尾部组织提取基因组DNA，以此为模板进行PCR、Real‑time PCR和染色体步移方法来鉴定其阳性。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵书红，肖倩，赵长志，林瑞意，经璐，李新云，李长春，余梅，成宏，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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