本发明专利技术公开了一种固相合成比伐芦定的方法。本发明专利技术的方法包括如下步骤：以Wang树脂为起始原料，合成Fmoc-Leu-载体树脂，在Fmoc-Leu-Wang树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相应的Fmoc-保护氨基酸，得到比伐芦定树脂，接入X片段时，用固相偶联合成反应，X片段对应的Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Gly-Gly-OH。本发明专利技术的方法避免了工艺杂质比伐芦定[-Gly]、工艺杂质比伐芦定[+Gly]的产生，大大降低了纯化的难度，提高了产品的收率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于多肽药物制备方法
，尤其涉及固相合成比伐芦定的方法。
技术介绍
中文名：比伐芦定 汉语拼音：Bifaluding 英文名称：Bivalirudin 药物别名：比瓦尔丁 英文别名：Angiomax ; 氨基酸序列： D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-IIe-Pro-Glu-Glu -Tyr-Leu-OH 化学文摘（CAS)号：128270-60-0 分子式：C98Hl38N24〇33 分子量：2180. 33 CAS 名称： D-Phenylalany1-L-proIy1-L-arginyl-L-proIylglycylglycylglycyIglycy1-L-asparaginylglycyl-L-a -aspartyl-L-phenylalanyl-L-a -glutamyl-L-a -gluta myl-L-isoleucyl- L-prolyl-L-α -glutamyl-L-α -glutamyl-L-tyrosyl-L-leucine 分子结构式：【主权项】1. 一种固相合成法合成比伐芦定的方法，其特征在于，包括如下步骤： 以Fmoc-Leu-载体树脂为起始原料，按照固相偶联合成的方法一次连接具有Fmoc保护 基团的氨基酸，获得保护的二十肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用缩合剂进行接肽 反应，获得保护的二十肽树脂后，进行脱侧链保护及裂解，获得比伐芦定粗品。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所用Fmoc-Leu-载体树脂替代度为： 0.6_L4mmol/g。优选为 0.6_0.8mmol/g。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述载体树脂选自：Trityl-Cl树脂、 4-Methyltrityl-Cl 树脂、4-Methoxytrityl-Cl 树脂或 2-C1 Trity-Cl 树脂；Wang 树脂或 对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：当载体树脂为Wang树脂时，Fmoc-Leu-OH 与载体树脂偶联的方法为：Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的羟基在缩合剂的作用下发生偶 联反应而接入保护氨基酸。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：Wang树脂反应前需要溶胀试剂，溶胀试剂 选自N，N-二甲基甲酰胺（DMF)、二氯甲烷（DCM)、N-甲基吗啡啉（NMM)、二甲基亚砜。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：偶联时需添加缩合试剂和活化试剂， 缩合试剂选自：N，N'_二异丙基碳二亚胺（DIC)、N，N'_二环己基碳二亚胺（DCC)、六氟磷 酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（PyBop)、2-(7_偶氮苯并三氮唑）-N，N，N'，N' -四 甲基脲六氟磷酸酯（HATU)、0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU)、0-苯并三氮 唑-N，N，N'，N' -四甲基脲四氟硼酸（TBTU)、N，N-二异丙基乙胺（DIEA)，活化剂选自：1-羟 基苯并三唑（H0BT)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑（H0AT)中的一种，催化剂为4-二甲氨 基吡啶（DMAP)。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：偶联时所用于溶剂选自：N，N-二甲基甲 酰胺（DMF)、二氯甲烷（DCM)、N-甲基吗啡啉（NMM)、二甲基亚砜（DMS0)中的一种。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的具有Fmoc保护基团的氨基酸分 别为：Fmoc-Tyr (tBu) -OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Phe-〇H> Fmoc-Asp (OtBu)-〇H> Fmoc-Gly-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Gly-Gly-〇H> Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：脱侧链保护及裂解使用的酸解试剂选自： 三氟乙酸（TFA)、1，2-乙二硫醇（EDT)的混合溶剂，其用量为每克肽树脂对应5-15mL;酸解 试剂的混合溶剂的配比为：TFA的体积分数为90-95%，EDT的体积分数为5-10%。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤如下： 制备 Fmoc-Leu-Wang 树脂： 将200gWang树脂（100?200目，1. lmmol/g)用800mLDCM浸泡30分钟，抽干。在上述 树脂中，在氮气搅拌的条件下加入DMAP2. 96g、Fmoc-Leu-0H233. 2g(FW:353. 1)、DIC 100mL、 HoBt 90g和DMF 800mL，室温反应8小时；反应结束后抽干溶液，DMF洗涤两次，抽干，加入 吡啶和乙酸酐溶液900mL打封闭，反应4小时；反应结束后抽干溶液，DMF洗涤六次，抽干， 加入甲醇溶液800mL收缩树脂体积6分钟。抽干液体，氮气吹干，获得Fmoc-Leu-Wang树脂 258g〇 封闭后Fmoc-Leu-Wang树脂的替代度为0. 71mmol/g ; 制备侧链全保护比伐芦定肽树脂： Fmoc-Leu-Wang树脂17. 46g，加入DMFlOOmL溶胀30分钟，抽干DMF，加入25 %脱保护试剂150mL，脱保护25分钟，用DMF洗涤六次，抽干，加入用DMFlOOmL溶解的 Fmoc-Tyr(tBu)-〇H 11.4g(FW:459.6)、DIC 3.88mL、HoBt 3.35g的混合物，接肽反应2小 时，反应终点以茚三酮检测阴性为准，抽干，用DMF洗涤两次，抽干，重复以上步骤，按照比 伐芦定肽序逐一与相应的Fmoc保护氨基酸偶联，各Fmoc保护氨基酸的摩尔当量与前述 Fmoc-Tyr (tBu) -0H相同，依次连接的保护氨基酸为： Fmoc-Tyr (tBu)-〇H> Fmoc-Glu (OtBu)-〇H> Fmoc-Glu (OtBu)-〇H> Fmoc-Pr〇-〇H> Fmoc-Ile-OH、 Fmoc_Glu(OtBu)-〇H、 Fmoc_Glu(OtBu)-〇H、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-〇H> Fmoc-Gly-〇H> Fmoc-Asn(Trt)-〇H> Fmoc-Gly-Gly-〇H> Fmoc_Gly-Gly-〇H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf) -OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH 制得侧链全保护比伐芦定肽树脂，其结构如下： NH2-D-Phe-Pr〇-Arg(Pbf)-Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Phe-Glu (0 tBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-Wang 树脂； 制备比伐户定粗品： 在 NH2-D-Phe-Pr〇-Arg (Pbf)-P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种固相合成法合成比伐芦定的方法，其特征在于，包括如下步骤：以Fmoc‑Leu‑载体树脂为起始原料，按照固相偶联合成的方法一次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得保护的二十肽树脂，其间依次脱去Fmoc‑保护基团，用缩合剂进行接肽反应，获得保护的二十肽树脂后，进行脱侧链保护及裂解，获得比伐芦定粗品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冷国庆，杨文龙，王丽莉，姚泽宇，沈清波，田辉，张琪，李迎新，
申请(专利权)人：哈尔滨吉象隆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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