本发明专利技术涉及一种植物乳杆菌植物亚种及其产抗单增李斯特菌细菌素的制备方法，适用于肉与肉制品、乳与乳制品、果蔬、即食食品防腐保鲜中。本发明专利技术从福建农贸市场的腊肉中筛选得到植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL(CGMCCNo.6936)。利用Zhang-LL菌株发酵得到产细菌素的发酵液，采用pH值依赖的吸附-解吸附法、阳离子交换层析法、反相高效液相色谱法提取与纯化Zhang-LL菌株细菌素，效价提高了32倍，纯度提高了36.65倍。该细菌素可抑制单增李斯特菌等多种食源性致病菌，抑菌活性高，对热及酸碱稳定，且被人体蛋白酶降解，是一种天然安全的生物防腐剂。该方法操作简单、稳定、高效，来源方便，成本较低，适于工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物领域中一株植物乳杆菌植物亚种及其产抗单增李斯特菌细菌 素的制备方法，该细菌素作为天然防腐剂适用于肉与肉制品、乳与乳制品、果蔬、即食食品 中，提高食品的安全性。
技术介绍
食品在加工、贮藏、运输等过程中，易受到有害微生物的污染而导致腐败变质或食 物中毒的发生，采用添加防腐剂来抑制微生物的生长，是防止食品腐败变质的重要手段。研 宄表明，一些化学防腐剂有致癌性、致畸性和引起食物中毒现象发生，对人体健康影响较 大，它的应用越来越受到众多国家的限制。而生物防腐剂是近年来发现的一类新型的天然 防腐剂，具有无毒、安全、性能稳定、适用性广等优点，常用的有乳酸链球菌素、纳他霉素、聚 赖氨酸、溶菌酶、鱼精蛋白等。 乳酸菌素是某些乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌 生物活性的肽或前体，对革兰氏阳性菌具有较好的选择性抑制生长能力，而且对热及酸碱 稳定性较好，可被人体蛋白酶降解等特点，因此乳酸菌素是天然安全的生物防腐剂。乳链菌 肽Nisin作为唯一被批准用作食品防腐剂的乳酸菌素，已经在五十多个国家和地区得到广 泛应用，然而其在碱性环境下稳定性差和热稳定性差等特点，大大限制了其在食品工业中 的应用。因此，研宄开发耐酸耐碱的新型的乳酸菌素将是对现有Nisin工业应用局限性的 一个极大的弥补。本项目从传统发酵食品中筛选出一株植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL，其 所产乳酸菌素对热和酸碱稳定，抑菌谱广，且能被胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K分解，作 为食品防腐保鲜剂具有较高安全性和稳定性，具备良好应用前景。因此，建立一种简单、高 效的制备生产乳酸菌素的方法尤为重要。目前，纯化细菌素的方法主要有pH吸附法，硫酸 铵沉淀、离子交换层析、凝胶层析、疏水交换层析、高效液相色谱等。 产生细菌素的菌株众多，但并不是所有的细菌素或其生产菌种都可应用于食品 中，只有那些公认安全（GenerallyRecognizedasSafe，GRAS)的菌种产生的细菌素才有 应用于食品生产中的可能。植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)属于乳杆菌科中的乳 杆菌属，革兰氏阳性，厌氧或兼性厌，能分泌合成多种有机酸、酶、生理活性物质等，是人体 胃肠道的益生菌群，能够维持肠道内菌群平衡。常存在于发酵蔬菜和果汁中，也广泛应用于 发酵肉制品。据中华人民共和国卫生部办公厅于2010年4月22日印发的《可用于食品的 菌种名单》（见附件1)，植物乳杆菌是其中明文规定的菌种之一，其为植物乳杆菌植物亚种 细菌素作为食品防腐剂提供了可靠依据。 有关植物乳杆菌所产细菌素的专利报道，如中国农业大学申请的"一种植物 乳杆菌及其细菌素发酵和制备方法与用途"，专利申请号为：CN201010528352.6 ;南京 农业大学申请的"一种植物乳杆菌、其细菌素以及培养与分离纯化方法"，申请号为： CN201310470098. 2 ;黑龙江八一农垦大学申请的"一种具有抗菌活性菌素的植物乳杆菌及 其应用"，申请号为：CN201410172324. 3;东北农业大学申请的"植物乳杆菌及其所产的可 抑制革兰氏阴性菌的细菌素"，申请号为：CN200910072654. 4;郑州大学申请的"一株植物 乳杆菌及其应用"，申请号为：CN201010281481.X。虽然目前国内有关于植物乳杆菌细菌素 制备方法的文献和专利，但有关于植物乳杆菌植物亚种细菌素制备方法尚无文献和报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种产广谱高效抑菌活性细菌素的植物乳杆菌植物 亚种Zhang-LL。 本专利技术所提供的乳酸菌是：植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)Zhang_LL，已于2012年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心（简称CGMCC)，保藏号为：CGMCCNo. 6936。植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)Zhang-LL， 分离筛选自福建农贸市场的腊肉制品。 在MRS培养基上，37°C培养2天，植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)Zhang-LL的菌落为乳白色圆形，表面光滑，中间凸起，不透明，边缘整齐， 直径约1mm;个体形态呈短杆状，大小0? 5X1. 33?2. 0ym，通常单生，成对或呈短链状排 列，不生芽孢，为革兰氏阳性耐氧或微好氧菌。 为了确定植物乳杆菌植物亚种的抑菌特性，对其发酵上清液的抑菌性能进行了测 定。测试菌株：单核细胞增生李斯特菌ATCC54003(简称单增李斯特菌）、金黄色葡萄球菌 ATCC29243 和CMCC26001、肠出血性大肠杆菌 0157 :H7ATCC43888、大肠埃希氏菌CMCC44110、 宋内志贺氏菌ATCC25931、痢疾志贺氏菌CMCC51105、都柏林沙门氏菌CMCC50761、伤寒 沙门氏菌CMCC50071、阪崎肠杆菌ATCC29544、枯草芽孢杆菌ACCC10243、铜绿假单胞菌 CICC21636、粪肠球菌CICC23658、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖杆菌、瑞士乳杆菌。试验 结果表明植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵上清液对粪肠球菌CICC23658、单增李斯特菌 ATCC54003、枯草芽孢杆菌ACCC10243、大肠埃希氏菌CMCC44110的生长有较强的抑制作用， 其中对单增李斯特菌的抑菌活性达到最高。 上述方法得到的具有抑菌活性的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL属于本专利技术保护 范围。 本专利技术的第二个目的是提供一种植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL所产细菌素的提 取方法。 (1)植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL按1 %接种量于MRS培养基中37°C发酵20h， 得到乳酸菌发酵液； (2)乳酸菌发酵液于80°C恒温水浴处理20min，冷却至室温后用lmol/LNaOH调节 pH 6. 0,室温振荡60min ; (3) 15 000r/min，4°C离心 15 ?20min，收集沉淀菌体，用pH6. 0 的 5mmol/L的磷 酸盐缓冲液洗涤菌体沉淀2次； (4)将沉淀悬浮在为原体积5%?10%的pH2. 0的100mmol/LNaCl溶液中，4°C 搅拌12h; (5) 15 000r/min，4°C离心15?20min，收集上清液，将上清液放入预处理的透析 袋于4°C去离子水中透析24h除盐，透析液即为细菌素粗提取液；(6)细菌素粗提取液于-35°C冷冻24h，利用真空冷冻干燥机于冻干温度-55°C、真 空度0.OSmBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到粗提取样品为白色粉末。 上述的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL产细菌素的提取方法也属本专利技术保护范 围。 本专利技术的第三个目的是提供一种简单有效的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL产细 菌素的纯化方法。 (1)将细菌素粗提取样品复溶于无菌蒸馏水，经0. 22 ym无菌滤膜过滤后，采用SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析法纯化细菌素，层析柱规格为10mmX 100mm;上样缓 冲本文档来自技高网...
【技术保护点】
植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang‑LL CGMCC No.6936。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张红星，刘慧，谢远红，郝艳芳，金君华，段慧霞，熊利霞，高秀芝，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。