PKD1基因突变的检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了用于通过长片段PCR和高通量测序技术检测PKD1基因突变的引物组、试剂盒和检测反应体系；用于非诊断目的的体外检测PKD1基因突变的方法、用于非诊断目的的体外PKD1基因分析方法和检测PKD1基因上的新突变位点的方法，所述方法通过使用该引物组对样品的PKD1基因进行长片段PCR扩增并进行高通量测序来进行检测或分析。本发明专利技术的检测结果不仅可以辅助诊断常染色体显性遗传性多囊肾病(即成人多囊肾病)，还可以获得多个PKD1真基因上的之前未知的新突变，并将其提供给医生或研究者以对这些突变与成人多囊肾病之间的关联性进行研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学分子生物学检测
，尤其涉及用于检测遗传性多囊肾病相 关的PKD1基因突变的引物组、试剂盒以及使用该引物组和试剂盒检测PKD1基因突变的方 法。
技术介绍
1 ?疾病及基因背景 常染色体显性遗传性多囊肾病（adultpolycystickidneydisease，APKD，又称 成人多囊肾病）是一种常见的先天遗传疾病，成人多囊肾病常于青中年时期被发现，也可 在任何年龄发病，为常见的遗传性多发性囊肿性肾病，发病率约为1/1，000-1/400,约占末 期肾脏病的5%。该疾病于中年时期在肾脏会慢慢形成囊肿及肿大，最后导致肾衰竭。常染 色体显性多囊肾的诊断主要依靠影像学或分子遗传学检测来明确。对于影像学检测，在年 龄30岁以上的患者或PKD1突变的年轻患者，检测的敏感度接近100% ;而在30岁以下的 PKD2突变年轻患者，检查的敏感度仅有67%。婴儿或者儿童在影像学检查中没有看到明显 的囊肿。常染色体显性多囊肾患者虽然在胎儿时期和/或出生时就已经发生基因突变，但 却在以后的生活中才出现多囊肾病的表现，许多患者在30岁前常因B超结果表现正常而漏 诊。因此，连锁分析或直接突变筛查等分子遗传检测有临床价值，通过基因检测提早诊断成 人多囊肾病成为新的研宄热点之一。此外，对胎儿的多囊肾病产前基因筛查还可以进行早 期诊断，有助于早期处理并发症。 可能存在3种基因引起成人多囊肾病，按发现先后分别命名为PKD1、PKD2、PKD3， 其中PKD1及PKD2基因已被克隆，成人多囊肾病基因突变后，引起多囊蛋白结构和功能异 常，继而导致囊肿发生及进行性长大。PKD1是造成成人多囊肾的最主要病因，约占85%， 且症状严重，而PKD2基因仅占10-15%，且症状较轻，基因外显子较少且无特殊结构，此处 不做探讨。PKD1基因定位于16pl3. 3-pl3. 12,长52kb，含46个外显子，其中外显子1-34为 多拷贝区，外显子35-46为单拷贝区，分别占基因70%和30%的区域，蛋白质产物由4302 个氨基酸残基构成的一种糖蛋白，称为多囊蛋白-1。 到目前为止，全世界已发现的PKD1基因突变位点有868个，统计发现？1(01基因突变没有明显的热点 区域，而且该数据库多为非中国人群突变，因此有大量中国人群特有的突变尚未发现，为了 提高对成人多囊肾病的诊断并进一步研宄PKD1基因突变与成人多囊肾病的关系，除了利 用已知的PKD1基因突变位点辅助诊断之外，还需要尽可能找出PKD1基因上之前未知的基 因突变，供医师和研宄者研宄这些突变与疾病之间的关联性。 PKD1基因中80%以上的突变均在占基因70%区域的多拷贝区，在染色体其它部 位还存在6个PKD1基因的同源序列区，均为同源性高达97. 8%的假基因，严重干扰PKD1真 基因的检测。为了获得真基因特异的突变，避免把假基因上的差异位点误判为真基因上的 致病突变，需要得到真基因的特异序列，因此在真基因与假基因序列有差异的位置设计真 基因特异的引物，但由于假基因相似性太高，且假基因数量多，导致可供设计特异引物位置 很少，距离远，因此需要进行5000bp甚至更长的长片段PCR。 长片段PCR是指扩增长度大于3kb的PCR，与一般的短片段PCR的区别在于，其受 DNA模板的二级结构、引物的特异性和退火温度、以及不理想的循环条件等因素的影响远大 于短片段扩增，导致其扩增难度大，特别是在长片段的PCR扩增中，常常会发生DNA脱嘌呤 作用，而模板DNA上的一个单独的损害就足以使PCR酶反应停顿，导致反应失败，因此扩增 稳定性很低，条件摸索非常困难，对于特定的引物和模板需要小心选择反应体系以使得能 够稳定进行长片段PCR反应。在PKD1的长片段PCR中由于引物必须选择真假基因差异位 点上，而且要求是尽量靠近引物3'末端才能提高扩增真基因特异性，因此引物设计受到非 常大的限制，可选择的余地非常少，只能通过调整扩增体系及反应条件来提高扩增成功率， 因此反应条件的优化至关重要。每个长片段PCR可能都有自己特异的扩增条件，目前国内 外针对PKD1长片段扩增的文献中均用到至少三种以上的反应条件来才能完成PKD1所有长 片段PCR，由于每个条件需要用到一台PCR仪，每进行一次长片段PCR都需要七到十个小时， 因此需要大量的PCR仪同时进行，或者需要大量的时间来轮换进行，加上实验的不稳定性， 因此需要耗费大量的人力物力和时间，效率低下，难以大规模的应用。 长片段PCR扩增完成后，传统的方案都是通过Sanger法进行测序，该方法被认为 是测序的金标准，但在进行PKD1检测时有较大的局限性，即一次的测序长度小于800bp，因 此需要先采用巢式PCR扩增出目的外显子，再进行Sanger法测序获取目标序列。但由于 PKD1基因过长，外显子多达46个，因此进行巢式PCR的次数和测序的次数过多，成本高，且 效率较低。虽然近年来开发出初筛方案，即巢式PCR产物先经过SSCP技术或DHPLC技术 进行初筛，这两种技术能够降低成本，快速的检测出是否存在突变，再对存在突变的区域用 Sanger法测序确认突变。但是由于技术本身原理所致，准确性不高，有较高的漏检率。而且 由于无法分辨基因中的多态，因此需要进行Sanger法测序的数量也不少。因此效率和准确 性仍然是局限应用范围的最大原因。 AdrianY.Tan等的方法（参见AdrianY.Tanetal.，Moleculardiagnosis ofautosomaldominantpolycystickidneydiseaseusingnext-generation sequencing,TheJournalofMolecularDiagnostics, 2014,Vol. 16,No. 2,pp216-228 ;以 下称AdrianY.Tan等的方法）公开了一种通过高通量测序对常染色体显性多囊肾病进行 分子诊断的方法，其中采用长片段PCR结合高通量测序的方法检测PKD1基因整个外显子编 码区，剪接位点区域及大部分5'和3'侧翼区的基因序列上的突变。但是，本申请人发现，在 该文章公开的方法中，部分引物长片段扩增后仍不能有效排除假基因的干扰，且引物稳定 性仍然不理想，而且需要经过3次PCR反应条件之后才能完成整个基因的扩增，用时较长， 效率较低。该方法采用的是IlluminaMiseq测序仪进行检测，该测序仪需要5到10天才 能测序完成，效率较低。而且，由于PKD1基因1号外显子序列的GC含量大于85%，导致1 号外显子测序质量较差。 因此，本领域仍然需要对PKD1基因突变进行更高效、准确的检测。
技术实现思路
本专利技术利用PKD1基因及其6个假基因的的序列比对的保守信息设计特异性引物， 采用统一的扩增反应条件，进行长片段PCR扩增出PKD1基因的特异性片段产物，将扩增产 物酶切打断后富集建库，并进行高通量测序，获得除外显子1之外的全部外显子及大部分 内含子的全部序列，随后通过生物信息学分析排除假基因位点干扰，获得PKD1真基因的突 变，并确保检测的特异性。 由于PKD1基因1号外显子序列的GC含量大于85%，而对于GC含量较高的区域进 行高通量本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于通过长片段PCR和高通量测序技术检测PKD1基因突变的引物组，包括下述引物：用于扩增PKD1基因外显子2‑7的引物，其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于扩增PKD1基因外显子8‑12的引物，其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；用于扩增PKD1基因外显子13‑21的引物，其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；用于扩增PKD1基因外显子22‑34的引物，其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；和用于扩增PKD1基因外显子35‑46的引物，其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨贵江，张泽樘，赵雪燕，杨扬，焦慧，
申请(专利权)人：北京圣谷同创科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11