本发明专利技术公开了一株新菌株--反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)zjut1104及其在拆分2，6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯中的应用，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年10月19日，保藏编号CCTCC NO：M 2014495，保藏地址为中国武汉武汉大学；本发明专利技术菌株对农药中间体(2，6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯)催化12h，底物转化率达到了29.5％，eep达到了92.5％，主要产物为(R)-2，6-二甲基苯基氨基丙酸。
【技术实现步骤摘要】
反硝化无色杆菌zjut1104及其应用(一)
本专利技术涉及一株反硝化无色杆菌zjut1104(Achromobacterdenitrificanszjut1104)及在生物催化领域的应用，该菌株具有很好的手性选择性拆分农药中间体的作用。(二)
技术介绍
N取代苯基α氨基丙酸是一类重要的手性合成中间体，特别是在农药领域，是很多手性农药的关键中间体，由该类中间体合成的农药已经形成了一类重要的农药体系--酰胺类农药，其中甲霜灵、氯霜灵、呋霜灵、异霜灵和苯霜灵为杀菌剂，异丙甲草胺、新燕灵和麦草伏为除草剂。这些农药不同光学异构体的生物活性是不同的，是典型的旋光活性农药。甲霜灵是酰胺类杀菌剂中最为普遍的成员，在世界防治卵菌亚纲病害(霜霉病和晚疫病)市场上甲霜灵产品占15％。甲霜灵同RNA聚合-I模板复杂作用，抑制核糖核苷酸三磷酸酯结合为核蛋白体RNA。甲霜灵因其烷基部分有一个不对称碳且无限制构形异构物(atropoisomer)不对称苯环取代基而具有手性。因此，甲霜灵由一对具有R和S构型的对映异构体组织。外对phyflaophtorainfextants和Pythiumultimmn生活活性测试表明R异构体大约比S异构体高1000倍。体内测试显示活性具有较小差异，R体比S体高3倍。因此，甲霜灵立体异构体具有相同的作用模式，但到达或者与受体结合的有效性方面具有显著的差异。R体相对于其对映体具有更高的生物活性，因此甲霜灵的杀菌活性主要来源于R体。外消旋甲霜灵目前在一些国家正在被主要由具有较高生物活性的R体组成的精甲霜灵所代替，典型的精甲霜灵产品由97.5％的R体以及2.5％的s体构成。光学纯或异构体产品替代外消旋(或异构体混合物)产品不仅提高了使用药效而且还能减少释放到环境中的农药总量，减少非活性异构体在生物圈内的扩展，从而减小对非靶标生物的潜在副作用。而且，光学纯产品的使用还有利于产品的生产、运输和储存。目前，大量的手性化合物的制备是通过化学拆分法完成的。利用生物催化拆分手性化合物比化学拆分法具有明显的优越性：(1)酶催化的反应通常具有高度的立体专一性。因此得到的产物旋光纯度很高，适于作各种生物活性和药理试验。(2)副反应少，产率高，产品分离提纯简单。(3)酶催化的反应大多在很温和的条件下进行，温度区间0～500℃，pH值接近中性。因此没有设备腐蚀问题，生产安全性也高。(4)酶无毒，易降解，不会造成环境污染，适于大规模生产。根据文献报道，南极假丝酵母脂肪酶和假单胞菌脂肪酶对该农药中间体实现了手性拆分，主要产物构型均为R型。南极假丝酵母脂肪酶催化速率比较高，立体选择性低，eep达到了69.4％，假单胞菌脂肪酶的手性选择性相当好，eep达到了99％，而催化速率比较慢。本专利技术菌株对该农药中间体，既具有很好的立体选择性，又有很高的催化速率。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种具有较好立体选择性的菌株--反硝化无色杆菌zjut1104(Achromobacterdenitrificans)及其在拆分农药中间体--2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株新菌株--反硝化无色杆菌(Achromobacterdenitrificans)zjut1104，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年10月19日，保藏编号CCTCCNO：M2014495，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。本专利技术还提供一种所述反硝化无色杆菌zjut1104在拆分2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯中的应用，具体所述的应用以反硝化无色杆菌zjut1104经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后的破碎混合液为催化剂，以2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯为底物，以吐温80为助溶剂，以pH＝8.0的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃、180rpm条件下进行催化反应，反应完全后，获得含(S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯和(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。进一步，所述催化剂用量以湿菌体重量计，所述湿菌体用量为10-80g/L反应体系，所述底物终浓度为48mmol/L反应体系，所述辅助底物的终浓度为20ml/L反应体系。进一步，所述湿菌体超声破碎的条件为：将湿菌体与磷酸盐缓冲液混合，在冰浴、500w条件下超声破碎10min，获得超声破碎混合液；所述磷酸盐缓冲液的体积用量以湿菌体重量计为25ml/g。进一步，本专利技术所述湿菌体的制备方法为：(1)将反硝化无色杆菌zjut1104接种至斜面培养基，在30℃培养1～2天，获得斜面菌体；所述每升斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂15～20g，自来水1000mL，用NaOH调节pH值为7.0，121℃灭菌20min；(2)将斜面菌体接种至种子培养基，在30℃培养12h，获得种子液；所述每升种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖10g，K2HPO42g，MgSO40.2g，自来水1000mL，用NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌20min；(3)将种子液以体积浓度1％～10％的接种量接种至发酵培养基，在30℃、180r/min、体积装液量5％的条件下培养24h，将发酵液离心，弃上清液，获得湿菌体；每升发酵培养基终浓度组成：蛋白陈5g，酵母粉2.5g，葡萄糖1g，橄榄油10g，K2HPO41g，MgSO40.2g，自来水1000mL，用NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌20min。进一步，所述混合液分离纯化的方法为：反应结束后，用氢氧化钠调节混合液的pH值至8-11，加入等体积的乙醚萃取(优选萃取1-3次，每次萃取时间10min以上)，分层(优选用分液漏斗进行两相分离)，得到水相a和有机相a；用盐酸调节水相a的pH值为2-5，加入等体积的乙酸乙酯萃取(优选萃取时间10min以上)，分层(优选用分液漏斗进行两相分离)，得到水相b和有机相b；将有机相b在35℃-60℃，转速为50rpm-150rpm条件下旋转蒸发除去乙酸乙酯，取浓缩物，即获得(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供一株新菌株--反硝化无色杆菌zjut1104，该菌株对农药中间体(2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯)催化12h，底物转化率达到了29.5％，产物对映体过量值达到了92.5％。而黄丽琴，杨红等人[2007]用皱褶假丝酵母催化拆分该农药中间体，催化反应120h底物转化率达到31.2％，产物对映体过量值为81.34％。(四)附图说明图1为菌株初筛时橄榄油作为唯一碳源，罗丹明B作为显色剂，稀释10-6菌落及荧光照片。图2为菌株初筛时农药中间体作为唯一碳源，溴甲酚紫作为指示剂，稀释10-6菌落及变色照片。图3为菌株初筛时农药中间体作为唯一碳源，罗丹明B作为显色剂，稀释10-6菌落及荧光照片。图4为反硝化无色杆菌zjut1104在LB固体培养基上培养2d的菌落形态。图5为反硝化无色杆菌zjut1104经革兰氏染色后的菌落形态。图6为反硝化无色杆菌zjut1104的不同菌体量催化农药中间体水解反应12h的转化率和ee值，e本文档来自技高网...
【技术保护点】
反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)zjut1104，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年10月19日，保藏编号CCTCC NO：M 2014495，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。
【技术特征摘要】
1.反硝化无色杆菌(Achromobacterdenitrificans)zjut1104，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年10月19日，保藏编号CCTCCNO：M2014495，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。2.一种权利要求1所述反硝化无色杆菌zjut1104在拆分2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用以反硝化无色杆菌zjut1104经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后的破碎混合液为催化剂，以2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯为底物，以吐温80为助溶剂，以pH＝8.0的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃、180rpm条件下进行催化反应，反应完全后，获得含(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以湿菌体重量计，所述湿菌体用量为10-80g/L反应体系，所述底物终浓度为48mmol/L反应体系，所述助溶剂的终浓度为20ml/L反应体系。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体超声破碎的条件为：将湿菌体与磷酸盐缓冲液混合，在冰浴，500w条件下超声破碎10min，获得超声破碎混合液；所述磷酸盐缓冲液的体积用量以湿菌体重量计为15～25ml/g。6.如权利要求3...
【专利技术属性】
技术研发人员：张朝晖，卢亚南，陈小龙，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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