一种云斑尖塘鳢精子超低温冷冻保存及复苏方法技术

本发明专利技术公开了一种云斑尖塘鳢精子超低温冷冻保存及复苏方法，其步骤是：1、一种云斑尖塘鳢精子超低温保存的方法：(1)云斑尖塘鳢精子的采集；(2)精子活力检测；(3)精子的稀释；(4)精液的冻前平衡；(5)加抗冻剂及分装；(6)程序降温；(7)进入液氮。2、一种云斑尖塘鳢精子超低温保存的复苏方法：(1)从液氮罐中取出冻精；(2)解冻；(3)冻精存放与备用；(4)人工授精。本发明专利技术的方法对云斑尖塘鳢精子进行超低温保存及复苏，从而为进一步开展云斑尖塘鳢的杂交育种、人工繁殖以及种质保存提供优质精液，为云斑尖塘鳢遗传改良奠定基础。本发明专利技术的方法操作简单，快捷，费用低廉，实用性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于水产养殖学领域，涉及鱼类种质保存技术，具体涉及。
技术介绍
目前，鱼类种质保存主要以精液保存为主。精子的保存可分为常温保存、低温保存以及超低温冷冻保存三种。精子的寿命随其能量的消耗殆尽而结束。其能量消耗主要在两个方面:一个是运动(摆尾游动)；第二是调节细胞内外渗透压平衡(非主动运输耗能)。因此，减缓精子的能量消耗，就可以将之寿命延长。常温保存是根据精子的生理特性，配制一定浓度的稀释液，从而减少精子用来调节渗透压平衡时的能量消耗进而延长精子的寿命，通常能够延长几十分钟至几小时之久。低温保存的原理是:低温能降低精子代谢活动(低温酶类效率降低)，通常能够延长几天至几十天。超低温保存则是让精子在超低温(-1960C )条件下，其运动和代谢几乎完全停止，精子处于类假死状态，生命以接近静止状态保存下来。精子在理想状态下能够无限期的保存，解冻后又会“复活”。云斑尖塘體(Oxyeleotrismarmorata)是我国引种并养殖的名贵淡水鱼品种，由于其体形似笋壳，故俗名为笋壳鱼。该鱼原产于东南亚泰国一带，最大个体可达5?6公斤，其肉质细嫩、营养价值高、味道鲜美且刺少，是一种名贵食用鱼，在东南亚各国和港澳、台湾等地区及日本深受消费者欢迎，是这些东南亚国家大宗出口的主要淡水鱼产品。由于产地国笋壳鱼仍停留在依靠自然资源捕获养殖的水平上，无法满足市场强劲的消费需求，导致目前该商品鱼市场批发价上涨到160?200元/kg。由此可见，云斑尖塘鳢的市场前景好，是一种新兴的、高产值、高效益的水产养殖新品种。为了能进一步开展云斑尖塘鳢的新品种选育、人工繁殖以及种质保存，为市场提供更加优质的云斑尖塘鳢新品种和苗种，需要进行云斑尖塘鳢精子超低温保存和人工繁殖。然而，无论是精子的超低温保存，还是进行人工繁殖，都需要一种稀释液对云斑尖塘鳢鲜精进行稀释，而且需要一种激活液对鲜精或冻精(经超低温保存后的精子再解冻)进行激活。云斑尖塘鳢精液中所含精子的密度很高，一般可以达到1.8X 19个/mL以上，当对云斑尖塘鳢精子进行超低温保存时，含高密度精子的精原液是不能直接进行超低温冷冻保存的，这是因为在冷冻过程中，当温度降到O V?-20 V区间时，被保存的精液中会形成冰晶，冰晶像锋利的刀一样刺向四周的精子，将精子刺破，精液中的精子密度越高，精子被刺破的概率也越高，这种在冷冻过程中冰晶对精子的物理损伤将直接导致精子超低温冷冻保存的失败。因此，冷冻前必须要对精子进行稀释。而在进行云斑尖塘鳢人工繁殖时，由于精液中含精子密度很高，若不稀释就用，不仅对该鱼精液是一种浪费，而且鲜精黏稠度大，使精子不易与卵子混合均匀，从而导致授精效果也不好。如果对精液进行稀释后，再用来进行人工授精，可大大降低人工授精的成本，同时还能起到很好的授精效果，获得较高的受精率。因此，云斑尖塘鳢精子稀释液的作用就是在不激活精子的前提下，对精子进行稀释，使精子尽可能的保持其原有的生物学特性。当精子被超低温保存时，为了提高精子的抗冻能力，除了对精液进行稀释外，还需要在稀释的精液中添加一定量的抗冻剂，如二甲亚砜(DMSO)等。由于抗冻剂具有很强的吸水性，当被添加到精液中后，可以使精子细胞内的一部分水被吸出。精子细胞的水分流失导致精子细胞内的细胞液浓度升高，精子的冰点也随之升高，从而提升了精子的抗冻能力。也正是由于精子细胞内的细胞液浓度升高，精子的渗透压也会随之升高。这样，冻精的渗透压与鲜精相比会高出30?40 %。含如此高内部渗透压的冻精，如果直接用淡水激活进行人工授精，在巨大的渗透压差作用下，其冻精一遇见水就可能破裂，从而使人工授精失败。解决这一问题的办法就是用具有一定渗透压的精子激活液来替代淡水对云斑尖塘鳢冻精进行激活，以减少这种渗透压差。因此，云斑尖塘鳢精子激活液的作用就是减少这种渗透压差，使得云斑尖塘鳢冻精在激活时不会破裂，顺利实现用冻精进行该鱼的人工授精。另外，精子激活液除了减少冻精与激活液间的渗透压差，保护冻精在激活过程中不破裂的作用外，对一般云斑尖塘鳢鲜精也有使精子活力优化的作用。这是因为激活液是由不同离子或大分子物质组成的，这些离子和大分子物质对精子的运动可以起到一定的优化作用。目前，由于环境恶化、近亲繁殖等引起的物种灭绝、种质退化、品质下降以及病害频发等现象日趋严重，超低温冷冻保存技术作为基因长期保存的有效工具逐渐成为解决这些问题的首选。此外，超低温保存技术还可以为遗传育种研宄长期不断的提供精子材料，这在雌雄核发育、性别控制及以精子作为载体生产转基因生物等方面均有应用价值。迄今对塘鳢科鱼类精子保存及复苏方法报道很少，未见对云斑尖塘鳢精子超低温冷冻保存及复苏方法的报道。由于云斑尖塘鳢属于热带鱼类，其原始祖先来自海洋，后来移居淡水生活，其精子保存及复苏方法既不同于淡水鱼类也不同于海水鱼类，按照已公开的淡水鱼类或海水鱼类精子保存及复苏方法对云斑尖塘鳢精子超低温冷冻保存及复苏均不成功；有待于进一步研宄。
技术实现思路
的
技术实现思路
包括云斑尖塘鳢精子超低温保存和复苏方法两大部分，其具体
技术实现思路
如下:一种云斑尖塘鳢精子超低温保存的方法，其步骤是:(I)云斑尖塘鳢精子的采集:选择性腺发育成熟的云斑尖塘鳢雄鱼，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水。用手轻轻挤压雄鱼腹部，待能挤出精液后，用干燥的滴管吸取精液，开始3-5滴精液不要采集，然后将精液挤入干燥的容器中，混匀。(2)精子活力检测:在10X20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到90%以上，平均曲线运动速度(VCL)达到35微米/秒以上，平均直线运动速度达到20微米/秒以上，该精子便可用于超低温冷冻保存。将镜检合格的精子放入4°C冰箱保存备用。(3)精子的稀释:准确量取需要被冷冻的云斑尖塘鳢精液，加入精液约3倍体积(为了分装方便，稀释液的量可适当增减一点，增减的量一般不超过总量的10%)的精子稀释液，使精液与稀释液的稀释比达到约1: 3。精液与稀释液混匀，备用。所述的精子稀释液为云斑尖塘鳢特有的精子稀释液，其配方为:7.0g/L氯化钠(NaCl)，lg/L氯化钾(KCl)，15g/L葡萄糖(C6H12O6)。该稀释液盐度7.3，pH为7.5。放置在4 °C冰箱保存，备用。(4)精液的冻前平衡:将稀释后的精液放入4°C冰箱，进行冻前平衡。云斑尖塘鳢精液的冻前平衡时间为15?45分钟。15分钟为最少平衡时间，如果平衡时间不到15分钟，则冷冻效果会下降。45分钟为最长平衡时间，15分钟到45分钟以内，冷冻效果没有差异，超过45分钟，则冷冻效果随着时间的延长逐渐降低。(5)加抗冻剂及分装:在平衡好的云斑尖塘鳢精液中直接加入抗冻剂，使抗冻剂在精液中的终浓度达到10%。抗冻剂加入后，立即混匀，分装至0.5mL麦管，6支麦管装入I个麦管套中，I个冷冻架上可放2个麦管套。注意所有的管内不能留有气泡，分装过程必须在冰面完成，分装完成的管子在没有进入程序降温仪前，应全部埋在冰里，确保管内的精液不会升温。所述的抗冻剂为二甲亚砜(DMSO)，无需配制，直接用原液。抗冻剂是利用其吸水作用，使精子中的部分水脱出，细胞质浓度升高，从而达到降低精子冰点的目的，防止精子在冷冻过程中精子内部形成冰晶。放置在4°C冰箱保存，备用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种云斑尖塘鳢精子超低温保存的方法，其步骤是：(1)云斑尖塘鳢精子的采集：选择性腺发育成熟的云斑尖塘鳢雄鱼，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水；用手轻轻挤压雄鱼腹部，待能挤出精液后，用干燥的滴管吸取精液，开头3‑5滴精液不要，然后将精液挤入干燥的容器中，混匀；(2)精子活力检测：在10×20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到90％以上，平均曲线运动速度(VCL)达到35微米/秒以上，平均直线运动速度达到20微米/秒以上，该精子便可用于超低温冷冻保存；将镜检合格的精子放入4℃冰箱保存备用；(3)精子的稀释：准确量取需要被冷冻的云斑尖塘鳢精液，加入精液3倍体积的精子稀释液，使精液与稀释液的稀释比达到1∶3；精液与稀释液混匀，备用；(4)精液的冻前平衡：将稀释后的精液放入4℃冰箱，进行冻前平衡；云斑尖塘鳢精液的冻前平衡时间为15～45分钟；(5)加抗冻剂及分装：在平衡好的云斑尖塘鳢精液中直接加入抗冻剂二甲亚砜(DMSO)，使抗冻剂在精液中的终浓度达到10％；抗冻剂加入后，立即混匀，分装至麦管；所有的管内不能留有气泡，分装过程必须在冰面完成，分装完成的管子在没有进入程序降温仪前，应全部埋在冰里；(6)程序降温：将分装好的精液以快速放入程序降温仪的冷冻室中；云斑尖塘鳢的降温程序从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至‑15℃，在‑15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从‑15℃降至‑85℃，最后在‑85℃处平衡10分钟；(7)进入液氮：降温完成后，直接将装有精液的麦管或冷冻管取出，立即放入液氮罐中，在‑196℃温度中保存。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：尹绍武，张国松，任乾，李鹏，王小军，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32