本发明专利技术公开了一种提取茶叶核酸的试剂，包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D；试剂A包括Tris、EDTA、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇以及作为溶剂的水；试剂B包括水饱和酚、吡咯烷酮、乙醇；试剂C包括氯仿和异戊醇；试剂D为无水乙醇。通过调整试剂A的配方比以及在试剂A中加入抗氧化剂等手段，减少茶叶中多酚、多糖类物质对核酸抽提的影响，进而可从茶叶中高效、快捷地提取DNA和RNA核酸(可去掉核酸)。该茶叶的DNA和RNA提取方法操作简单，成本非常低，提取效果好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物
，更具体地说，涉及一种破除茶叶细胞壁，提取茶叶 DNA和RNA的试剂及使用该试剂提取茶叶DNA和RNA的提取方法。
技术介绍
优良品种的茶树都是长期精心选育而成的，传统的茶树品种的鉴定是根据其物理 特性（例如芽叶肥瘦、大小、叶色、叶片厚薄等）和鲜叶化学成分进行鉴别。随着分子诊断 技术的发展，使聚合酶链式反应（PCR)、探针杂交、核酸测序等分子生物学方法直接检测茶 树和茶叶的遗传特性和基因表达情况成为可能。通过对茶叶DNA的检测可以判断茶叶遗传 特性，而对茶叶RNA的检测，可以判断茶叶的基因表达情况，以推测茶叶的性状。利用遗传 背景相同的茶叶，在不同地域或接受不同培养方法，其生长情况会发生变化，茶叶性状也发 生变化。分子诊断技术的第一步就是模板核酸的制备，即样品中核酸的提取，这直接影响着 检测的结果。 茶叶中含有的次生代谢物质最为复杂，特别是对DNA提取影响极大的多酚类物质 在茶叶中的含量是所有植物中最高的，因此，茶叶样品中核酸的提取和纯化一直是耗时，繁 琐的过程。虽然目前有分别提取茶叶DNA和RNA的方法，但是这些方法的原理和操作过程 各不相同，没有一个公认的可以同时对茶叶的DNA和RNA进行高效的共同提取的方法。 众所周知，茶叶由于细胞壁比较难以破裂，因此在其核酸提取（尤其是RNA)方面， 效果一直不很理想。目前茶叶的核酸提取主要采用裂解细胞后提取核酸的方法，其中常用 的破壁方法主要包括：超声研磨，加入表面活性剂或变性剂，以及一些提取试剂盒等。目前 被广泛采用的市场销售的RNA提取试剂盒价格昂贵，操作步骤繁琐，并且提取效果也并不 理想。因此，如何从茶叶中高效、快捷的共同提取DNA和RNA核酸，已成为了目前分子诊断 技术等技术在茶叶品种、品质鉴定领域中应用的一个瓶颈。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有技术的多酚类物质影响茶叶破壁及RNA 的提取的缺陷，提供一种破除茶叶细胞壁，提取茶叶DNA和RNA的试剂及使用该试剂提取茶 叶DNA和RNA的提取方法。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种提取茶叶核酸的试剂，包括试 剂A、试剂B、试剂C、试剂D;其中，试剂A包括Tris、EDTA、3--1-丙磺酸、 十二烷基肌氨酸钠、0 -巯基乙醇以及作为溶剂的水；其中Tris的浓度为5-10mM;EDTA的 浓度为5-10mM;3--1-丙磺酸的体积百分含量浓度为 0. 05% -0. 2%、十二烷基肌氨酸钠体积百分含量浓度为0. 05% -0. 2% ; 0 -巯基乙醇的体 积百分含量浓度为0. 1-0. 5% ; 试剂B包括水饱和酚、吡咯烷酮、乙醇；水饱和酚、吡咯烷酮、乙醇的体积比为 (99-98):1:1 ； 试剂C包括氯仿和异戊醇；氯仿和异戊醇的体积比为25:1 ; 试剂D为无水乙醇。 本专利技术所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂A的pH值为7. 2-7. 8。 本专利技术所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂B的pH值为5-8。 本专利技术所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂A按照如下方法制备：将十二 烷基肌氨酸钠、0 _巯基乙醇、Tris、EDTA、3--1-丙磺酸 和水混合，得到试剂A。 本专利技术所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂B按照如下方法制备：将水饱 和酚、乙醇、吡咯烷酮混合，得到试剂B。 本专利技术所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂C按照如下方法制备：将氯仿 和异戊醇混合，得到试剂C。 本专利技术还包括一种茶叶核酸的提取方法，利用上述的提取茶叶核酸的试剂进行提 取，包括如下步骤： S1、茶叶的研磨：将茶叶磨碎得到茶叶粉末； S2、去除茶叶的细胞壁，得到去细胞壁的茶叶裂解液：使用试剂A与茶叶粉末混 匀，再加入试剂B，混匀，进行裂解反应，得到反应液；将反应液离心收集上层水相，即得到 去除细胞壁的茶叶裂解液； S3、纯化去细胞壁的茶叶裂解液：在去除细胞壁的茶叶裂解液中加入等体积的试 剂C，进行纯化反应，得到纯化裂解液； S4、得到茶叶的DNA和RNA:在纯化裂解液中加入等体积的试剂D，混匀，离心得到 茶叶细胞内的DNA和RNA。 本专利技术所述的茶叶核酸的提取方法，其中，所述茶叶、试剂A和试剂B的配比为 1ug-lg：400y1 ：400y1〇 本专利技术所述的茶叶核酸的提取方法，其中，S2中所述的裂解反应时间为 30-60min〇 本专利技术所述的茶叶核酸的提取方法，其中，S3中所述纯化反应温度为60-70°C。 实施本专利技术的一种破除茶叶细胞壁，提取茶叶DNA和RNA的试剂及使用该试剂提 取茶叶DNA和RNA的提取方法，具有以下有益效果： (1)通过调整试剂A的配方比以及在试剂A中加入抗氧化剂等手段，减少茶叶中多 酚、多糖类物质对核酸抽提的影响，进而可从茶叶中高效、快捷地提取DNA和RNA核酸（可 去掉核酸）。 (2)该茶叶的DNA和RNA提取方法操作简单，成本非常低，提取效果好。【附图说明】 下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中： 图1为本专利技术较佳实施例1中茶叶提取的核酸与CTAB法提取的核酸的甲醛变性 胶电泳对比图。【具体实施方式】 下面结合【具体实施方式】，对本专利技术做进一步描述： 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 下述实施例所用的试剂： 试剂六包括1^8、￡014、3--1-丙磺酸、十二烷 基肌氨酸钠、0 -巯基乙醇；Tris在试剂A中的浓度为5-10mM;EDTA在试剂A中的浓度为 5-10mM;3--1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠在试剂A中的 体积百分含量浓度均为0. 05% -0. 2% ; 0 -巯基乙醇在试剂A中的体积百分含量浓度为 0. 1-0. 5%； 所述试剂A按照如下方法制备：将十二烷基肌氨酸钠、0 -巯基乙醇、Tris、EDTA、 3_-1-丙磺酸和水混合，得到试剂A;所述试剂A的pH值 为7. 2-7. 8。试剂A的配方组分中，除了Tris外都有抗氧化的作用，这个组分的作用主要 是针对如何减少多酚类物质而设想的。 试剂B包括水饱和酚、吡咯烷酮、乙醇；水饱和酚、吡咯烷酮、乙醇的体积比为 (99-98):1:1 ； 所述试剂B按照如下方法制备：将水饱和酚、乙醇、吡咯烷酮混合，得到试剂B;其 中，所述试剂B的pH值为5-8。因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化 发黄，而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联，故在制备酚饱和液时 要加入一特殊物质，以防止酚氧化。 试剂C包括氯仿和异戊醇；氯仿和异戊醇的体积比为25:1 ;所述试剂C按照如下 方法制备：将氯仿和异戊醇混合，得到试剂C;氯仿可去除脂肪，使更多蛋白质变性，从而提 高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。 试剂当前第1页1 2 3 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提取茶叶核酸的试剂，其特征在于，包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D；其中，试剂A包括Tris、EDTA、3‑[(3‑胆固醇氨丙基)二甲基氨基]‑1‑丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β‑巯基乙醇以及作为溶剂的水；其中Tris的浓度为5‑10mM；EDTA的浓度为5‑10mM；3‑[(3‑胆固醇氨丙基)二甲基氨基]‑1‑丙磺酸的体积百分含量浓度为0.05％‑0.2％、十二烷基肌氨酸钠体积百分含量浓度为0.05％‑0.2％；β‑巯基乙醇的体积百分含量浓度为0.1‑0.5％；试剂B包括水饱和酚、吡咯烷酮、乙醇；水饱和酚、吡咯烷酮、乙醇的体积比为(99‑98):1:1；试剂C包括氯仿和异戊醇；氯仿和异戊醇的体积比为25:1；试剂D为无水乙醇。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谭嘉力，张娟，
申请(专利权)人：广东粤检生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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