抗Her1的治疗性抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种能够结合人Her1细胞外子区域D4的全人源单克隆抗体，该抗体能够抑制肿瘤细胞的增殖并诱导肿瘤细胞的死亡。本发明专利技术通过构建合成的全人源噬菌体抗体库并淘选出相应的抗体，通过与细胞外域Her1 ECD和其他子区域D1D2，D3和D3D4的结合特性分析，显示出本发明专利技术的抗体具有比尼妥珠单抗更强的亲和力，可以和其他抑制Her 1细胞外子区域D3的抗体联合使用用于治疗Her 1过表达的恶性疾病。

【技术实现步骤摘要】
抗Her1的治疗性抗体
本专利技术涉及一种全人源的IgG1型抗体，该抗体与人表皮生长因子受体(EGFR或Her1)的细胞外域的不同子区域结合。本专利技术进一步涉及该抗体抑制Her1表达的肿瘤细胞增殖的方法。本专利技术还涉及这类抗体对于治疗各种恶性疾病的用途。
技术介绍
Her家族与肿瘤的联系已经在文献中被广泛描述，这些受体通过同型或异型二聚物的形式在激酶家族成员内形成信号复合物(YardenandSliwkowski,NatRevMolCellBiol.2001,2:127-37)。抗Her家族成员的药物能够抑制配体结合和受体的激活，经由补体依赖的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)诱导受体内化和向下调节，增强受体降解来介导免疫系统应答(CiardielloandTortora,NEnglJMed.2008,358:1160-74)。Her1是一个已经被验证的肿瘤免疫治疗的靶点(Mendelsohn,EndocrRelatCancer.2001,8:3-9)。在目前的临床实践中，一个治疗策略就是针对受体的特异性抗体的应用，包括西妥昔单抗、帕尼单抗和尼妥珠单抗(etal.,ImmunolLett.2008,116:126-40；Quatraleetal.,FrontBiosci(LandmarkEd).2011,16:1973-85)。尼妥珠单抗在临床上成功用于内皮源性肿瘤的治疗(Ramakrishnanetal.,MAbs.2009,1:41-8)。众所周知，正如西妥昔单抗和帕尼单抗，尼妥珠单抗作用于Her1的细胞外子区域3(D3)。最近的研究显示，同时靶向Her1的非竞争性抗体会更加有效，应用两种抗D3的抗体比单独应用一种抗体，使得具有配体自分泌功能的迁移和增殖细胞会在更大的程度上被抑制。抗体的联合应用会增加受体的向下调节，不必激活下游的信号传导(Spangleretal.,ProcNatlAcadSciUSA.2010,107:13252-7)。又一个近期在II期临床试验中被应用的抗D3抗体连用的例子，就是Sym004(Koefoedetal.,MAbs.2011,3:584-95)，能够协同抑制肿瘤细胞的生长。Sym004能够在体内和体外诱导小鼠异种移植模型上的受体转移，等效或强效于西妥昔单抗或帕尼单抗(Pedersenetal.,CancerRes.2010,70:588-97)。此外，这种联合应用显示了在西妥昔抵抗的细胞模型上体内和体外的抗肿瘤活性(Iidaetal.,Neoplasia.2013,15(10):1196-206)，同时增加了人肺和头颈部细胞的辐射敏感性(Huangetal.,MolCancerTher.2013,12:2772-81)。非竞争性的抗D3抗体和西妥昔单抗或帕尼单抗都已经被鉴定出来。这种结合能够增强受体的降解，抑制增殖和体外的三阴性乳腺癌细胞的异种移植生长(Ferraroetal.,ProcNatlAcadSciUSA.2013,110:1815-20)。因此，研究靶向于Her1细胞外域多个不同子区域的新的单克隆抗体是提高EGFR靶点治疗概念的一个极具吸引力的课题。尤其是，到目前为止，在临床上还没有靶向于D4子区域的抗体被评价。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于获得识别Her1细胞外子区域4(D4)的全人源单克隆抗体。本专利技术的另一个主要目的是应用这类单克隆抗体治疗Her1表达的肿瘤。相应地，本专利技术涉及从合成的全人源噬菌体抗体库中挑选结合重组Her1细胞外子区域3-4(D3D4)的全人源单克隆抗体；这些抗体在抑制Her1表达的肿瘤细胞的增殖和诱导细胞死亡中的用途；这些抗体和其他抑制Her1细胞外子区域D3的抗体在治疗一些恶性疾病中的联合使用。本专利技术的技术方案如下：本专利技术同时提供了一种能够结合人Her1细胞外子区域D4的全人源单克隆抗体，该抗体能够抑制肿瘤细胞的增殖并诱导肿瘤细胞的死亡，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其重链可变区依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO1或17所示；所述CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO2或18所示；所述CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO3或19所示；其轻链可变区依次包含高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’，所述CDR1’的氨基酸序列如SEQIDNO4或20所示；所述CDR2’的氨基酸序列如SEQIDNO5或21所示；所述CDR3’的氨基酸序列如SEQIDNO6或22所示。其重链框架区序列如SEQIDNO7-10或SEQIDNO23-26所示，其轻链框架区序列如SEQIDNO11-14或SEQIDNO27-30所示。其重链核苷酸序列如序列SEQIDNO15或31所示，轻链核苷酸序列如序列SEQIDNO16或32所示。本专利技术同时提供了一种单克隆抗体，能够识别Her1ECD和D3D4，但不能单独识别D1D2或D3。本专利技术提供的全人源单克隆抗体，所述的抗体能够导致体外抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞死亡的活性。本专利技术同时提供了所述的全人源单克隆抗体的筛选方法，该筛选方法包含下面的步骤：(1)获得合成的人噬菌体展示Fab片段库；(2)筛选：应用重组Her1细胞外子区域D3D4从人抗体库中筛选；(3)评价结合特性：应用Her1细胞外域ECD和子区域D1D2,D3和D3D4来评价选中的特异性抗体的结合特性；(4)评价Her1过表达的肿瘤细胞系的抗增殖和诱导细胞死亡的效果。本专利技术提供了所述的全人源单克隆抗体用于制备治疗EGFR过表达的恶性疾病的药物中的用途。其中，所述的药物为一种治疗性抗体联合应用靶向于Her1子区域D3的另一种治疗性抗体。其中所述的一种治疗性抗体是如上所述的全人源单克隆抗体，所述的另一种治疗性抗体是尼妥珠单抗。本专利技术的另一个优选的实施例是关于D1和E1抗体在Her1表达的肿瘤细胞中对于抑制增殖和诱导细胞死亡的能力的实验。附图说明图1：合成的scFv模板基因(VH-linker-Vlambda)，用于构建抗体库。两侧是限制性酶切位点ApaLI和NotI，在每个CDR3区包含连续3个终止密码子。图2：在pHAB噬菌粒内基于scFv模板基因的基因构建。图3：反义诱变寡核苷酸，用于增加库中CDR3序列中VH(A-C)andVλ(D-E)的多样性。图4a：pTSE质粒载体图。图4b：组氨酸标记的Her1细胞外子区域I-II(D1D2)和III-IV(D3D4)的表达。Her1的细胞外域应用亲和色谱柱纯化(Leónetal.,JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci.2009,877:3105-10)。图4c：尼妥珠单抗对重组Her1细胞外域和它的子区域的结合。抗人CD6抗体T1h用作阴性对照(Roque-Navarroetal.,HybridHybridomics.2003,22:245-57)。图4d：D1和E1抗体对于重组Her1细胞外域的D3D4的结合。图5a：单生物素化的重组Her1细胞外域D1D2,D3和D3D4的表达。图5b：尼妥珠单抗hR3、D1和E1对重组Her1细胞外域和它的子区域的结合。图5C：D1和E1抗体的亲和力本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够结合人Her1细胞外子区域D4的全人源单克隆抗体，该抗体能够抑制肿瘤细胞的增殖并诱导肿瘤细胞的死亡，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述抗体重链可变区依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1的氨基酸序列分别如SEQ ID NO 1，17所示；所述CDR2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO 2，18所示；所述CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO 3，19所示；所述抗体轻链可变区依次包含高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’，所述CDR1’的氨基酸序列分别如SEQ ID NO 4，20所示；所述CDR2’的氨基酸序列分别如SEQ ID NO 5，21所示；所述CDR3’的氨基酸序列分别如SEQ ID NO 6，22所示。

【技术特征摘要】
1.一种能够结合人Her1细胞外子区域D4的全人源单克隆抗体，该抗体能够抑制肿瘤细胞的增殖并诱导肿瘤细胞的死亡，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述抗体重链可变区依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO1或17所示；所述CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO2或18所示；所述CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO3或19所示；所述抗体轻链可变区依次包含高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’，所述CDR1’的氨基酸序列如SEQIDNO4或20所示；所述CDR2’的氨基酸序列如SEQIDNO5或21所示；所述CDR3’的氨基酸序列如SEQIDNO6或22所示。2.根据权利要求1所述的全人源单克隆抗体，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗哈斯，洛佩兹，莫莱诺，罗兰多，白先宏，李倩，李桂珠，侯福月，李晓敏，
申请(专利权)人：百泰生物药业有限公司，分子免疫中心，
类型：发明
国别省市：北京;11