本发明专利技术公开了一种利用细胞膜荧光染料在体内外定量测定细胞增殖速度的方法，包括如下步骤：a）细胞膜荧光染料染细胞；b）不同浓度血清的培养基培养染色后细胞；c）收取细胞，计数并检测每个细胞平均荧光强度，根据荧光强度和细胞分裂次数利用统计软件获得对数拟合公式，绘制标准曲线；通过每个细胞平均荧光强度和细胞分裂次数的标准曲线，可测定体内外一群细胞或细胞亚群的增殖速度。本方法可应用于体外细胞分裂次数的定量检测、体外肿瘤细胞亚群耐化疗药物的定量测定、体内移植细胞的分裂速度，并能分选各个分裂速度不同的细胞亚群，测定分选后细胞的RNA、蛋白和生物功能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种在体内外定量测定细胞增殖的方法，具体是一种利用细胞膜荧光 染料在体内外定量测定细胞增殖速度的方法，属于生物检测
技术介绍
细胞增殖是生物体的重要生命特征。细胞以分裂的方式进行增殖，用来补充体内 衰老和死亡的细胞。细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下通过DNA复制、RNA转录 和蛋白质合成等复杂反应而进行分裂的一系列过程。细胞增殖检测技术广泛应用于分子生 物学、遗传学、肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力学等研究领域。 目前，检测细胞增殖的技术主要包括渗透实验、直接增殖测定和细胞代谢法三种。 (1)渗透实验。这种方法用来染细胞膜破损的细胞，活细胞不会被台盼蓝染成蓝 色，然后通过细胞计数器手动计数细胞数目。此方法快速、便宜、仅仅需要一少部分细胞。 细胞传代、冻存或其它实验可以用这种方法。或者也可以通过流式细胞仪来计数细胞数目。 检测前可以染PI排除死细胞。 (2)直接增殖测定。这种方法利用DNA整合来测定细胞增殖。此方法利用整合到 DNA中的放射性或非放射性的核酸类似物来检测。比如：Brdu免疫化学染色法需要将细胞 或组织标本经过变性处理，这就影响了标本的结构，使标本不适合下游实验，也使得染色结 果及程度过分地依赖于不同实验所应用的不同条件。 (3)细胞代谢法。这种方法是将四唑盐加入细胞培养基内，这些四唑盐可以被活细 胞转化为有颜色的甲瓒，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值可间接反映活细胞数量。此方 法已广泛用于各种细胞增殖的检测，生物活性因子的活性检测，大规模的抗肿瘤药物筛选， 细胞毒性试验等。 常用荧光染料DAPI可用于细胞核的染色，但一般用来染死细胞。有研究利用细 胞膜荧光染料PKH26对肿瘤细胞染色后，根据肿瘤细胞PKH-Pos和PKH-Neg或PKHhigh和 PKH1?来分离恶性肿瘤干细胞，但是这种定性检测不能定量分析出细胞分裂次数。PKH26染 细胞时需要经过多次洗涤细胞的过程及加入不同的试剂，因此染色比较复杂和费时。而且， 它虽然可以用来在体内外对细胞进行示踪，但是，不能用来做冰冻切片和特殊的爬片技术。 荧光染料CFSE可以对组织及淋巴器官中的淋巴细胞进行示踪及定位。有研究用CFSE检测 人和鼠体内外检测淋巴细胞增殖，CFSE稳定地标记细胞内的分子，细胞每分裂一次，荧光强 度减半。通常，淋巴细胞标记CFSE后，其分裂8次后流式仍然可以检测到。因细胞分裂次 数不同淋巴细胞分化程度就不同，通过带有不同荧光染料的抗体用流式细胞技术检测不同 的细胞表面分子、胞内蛋白及细胞因子。进而，利用合适的细胞表面标志物可以在一群复杂 的细胞中对特定的淋巴细胞亚群和细胞分裂次数同时进行量化。在利用CFSE标记细胞时， 要特别注意表型分析过程中荧光的选择以避免光谱的重叠。降低CFSE染细胞时的浓度将 会减少检测时调节补偿的问题，但同时也限制了我们可以观察到的细胞分裂次数。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用细胞膜荧光染料在体内外定量测定细胞增殖速度 的方法，该方法是通过每个细胞平均荧光强度和细胞分裂次数的标准曲线，实现对体内外 一群细胞或细胞亚群的增殖速度的测定，该方法可应用于体外细胞分裂次数的定量检测、 体外肿瘤细胞亚群耐化疗药物的定量测定、体内移植细胞的分裂速度，并能分选各个分裂 速度不同的细胞亚群，测定分选后细胞的RNA、蛋白和生物功能。 本专利技术的技术方案如下：一种利用细胞膜荧光染料在体内外定量测定细胞增殖速 度的方法，为如下步骤： (1) 以细胞膜荧光染料染细胞：取细胞膜荧光染料配制成储存浓度为lmm〇l/L的染液， 将储存浓度为lmm〇l/L的染液加入到无血清培养基中配制成工作浓度为5~10umol/L的染 液，再将工作浓度为5~10umol/L的染液与重悬于无血清培养基的细胞悬液按体积比1:1 混合，并轻轻吹打，使充分混匀，然后置于37°C孵箱孵育2~30min，完成细胞染色；所述细胞 膜荧光染料为细胞膜绿色荧光染料DiO或荧光染料PKH;所述孵育时间大于lOmin时，每 lOmin将染液与细胞悬液轻轻吹打，混匀一次； (2) 染色后细胞的培养：配制含不同血清浓度的培养基，将各培养基分别加入细胞培养 板中，每孔2ml，每种血清浓度设立两个复孔，将染色后的细胞以5X104个/孔的密度平均 铺于上述事先加入了含不同血清浓度培养基的细胞培养板中，在37°C、5%C02、饱和湿度 条件下进行染色后细胞的常规培养； (3) 标准曲线绘制：培养一周后，收取细胞，用细胞计数板计数每孔细胞数目，以流式 细胞仪检测每孔细胞的平均荧光强度；以M#为平均荧光强度，S表示细胞分裂次数，利用R 软件经统计分析，建立细胞分裂次数S与细胞平均荧光强度M#的对数拟合关系式：S=Alog2 M#+B，并利用excel绘制出对数拟合曲线；所述对数拟合关系式中的系数A和B为常数， 由统计分析获得；所述收取细胞的方法是：以浓度〇. 05%的胰酶细胞消化液Trypsin-EDTA 消化细胞l~3min，然后置于流式管中，以1000~1200rpm转速离心3~8min，小心去上清后重 悬于200~500ulPBS磷酸盐缓冲液中，重悬的缓冲液体积取决于细胞数量，调整细胞密度至 1X106/ml； (4) 体内外细胞增殖速度的定量测定：测定待测细胞的平均荧光强度M#，然后根据步 骤（3)中建立的细胞分裂标准曲线或对数拟合关系式，计算得到细胞分裂次数S。 本专利技术所述细胞膜荧光染料优选为细胞膜绿色荧光染料DiO或荧光染料PKH。 本专利技术所述对数曲线拟合的获得：以M#为平均荧光强度，N表示细胞数目，S表示 细胞分裂次数，1^为初始荧光强度，Nto、N#分别为细胞初始数目和分裂S次后的细胞数目。 经过实验验证，细胞经过荧光染色后，荧光在10天内没有衰减，并且细胞每分裂一次，荧光 平均分配到两个子代细胞中，那么可以推出Mto*?=M#*N#，log2Mto/M#=S=log2N#/N 初，即S=log2Mto-log2M#，由于初始荧光强度是一定的，因此S和M末可进行对数曲线拟合 获得细胞分裂标准曲线。 本专利技术利用细胞膜荧光染料在体内外定量测定细胞增殖的方法，还可以是如下步 骤： (1)以细胞膜荧光染料DiO染细胞：取细胞膜绿色荧光染料DiO配制成储存浓度为 lmmol/L的DiO染液，将储存浓度为lmmol/L的DiO染液加入到事先预热至37°C的无血清 培养基中，配制成工作浓度为5umol/L的DiO染液，然后将工作浓度为5umol/L的DiO染液 与重悬于无血清培养基的细胞悬液按体积比1:1混合，轻轻吹打，充分混匀，然后将细胞置 于37°C孵箱孵育2~30min，每lOmin混匀一次； (2) 染色后细胞的培养： A.分别配制含血清浓度10%、5%、2. 5%、1. 25%、0. 625%的培养基，将各培养基分别加入 细胞培养板中，每种血清浓度设立两个复孔； b.将步骤（1)获得的染色后的细胞平均铺于上述事先加入含不同血清浓度培养基的 细胞培养板中，在37°C、5%C02、饱和湿度条件下进行常规培养； (3) 标准曲线绘制： a. 培养一周后，以浓度0. 05%的胰酶细胞消化液Trypsin-E本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用细胞膜荧光染料在体内外定量测定细胞增殖速度的方法，其特征在于：为如下步骤：以细胞膜荧光染料染细胞：取细胞膜荧光染料配制成储存浓度为1mmol/L的染液，将储存浓度为1mmol/L的染液加入到无血清培养基中配制成工作浓度为5~10umol/L的染液，再将工作浓度为5~10umol/L的染液与重悬于无血清培养基的细胞悬液按体积比1:1混合，并轻轻吹打，使充分混匀，然后置于37℃孵箱孵育2~30min，完成细胞染色；所述孵育时间大于10min时，每10min将染液与细胞悬液轻轻吹打，混匀一次；染色后细胞的培养：配制含不同血清浓度的培养基，将各培养基分别加入细胞培养板中，每孔2ml，每种血清浓度设立两个复孔，将染色后的细胞以5×104个/孔的密度平均铺于上述事先加入了含不同血清浓度培养基的细胞培养板中，在37°C、5% CO2、饱和湿度条件下进行染色后细胞的常规培养；标准曲线绘制：培养一周后，收取细胞，用细胞计数板计数每孔细胞数目，以流式细胞仪检测每孔细胞的平均荧光强度；以M末为平均荧光强度，S表示细胞分裂次数，利用R软件经统计分析，建立细胞分裂次数S与细胞平均荧光强度M末的对数拟合关系式：S=Alog2 M末+B，并利用excel绘制出对数拟合曲线；所述对数拟合关系式中的系数A和B为常数，由统计分析获得；所述收取细胞的方法是：以浓度0.05%的胰酶细胞消化液Trypsin‑EDTA消化细胞1~3min，然后置于流式管中，以1000~1200rpm转速离心3~8min，小心去上清后重悬于200~500ulPBS磷酸盐缓冲液中，重悬的缓冲液体积取决于细胞数量，调整细胞密度至1×106/ml；体内外细胞增殖速度的定量测定：测定待测细胞的平均荧光强度M末，然后根据步骤（3）中建立的细胞分裂标准曲线或对数拟合关系式，计算得到细胞分裂次数S。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：聂飚，柳雪花，邓飞鸿，陈金敏，左俊华，
申请(专利权)人：聂飚，
类型：发明
国别省市：广东;44
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