本发明专利技术具体涉及以NQO1为靶点的抗肿瘤药物作为NAD+合成通路抑制剂在治疗恶性肿瘤中的应用。NQO1靶向的抗肿瘤药物(以丹参酮IIA及β-拉帕醌为例)，可以显著降低氨基酸转运体LAT1表达，阻断NAD+从头合成来源物质色氨酸转运，减少NAD+各合成中间产物的含量，抑制细胞内NAD+合成，使肿瘤细胞能量代谢受阻。本发明专利技术发现抗肿瘤药物丹参酮IIA及β-拉帕醌作为NAD+合成抑制剂在肿瘤治疗中的应用，可应用于医药工业。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术具体涉及以NQOl靶向的抗肿瘤药物作为NAD+合成通路抑制剂在治疗恶性肿瘤中的应用，可应用于医药工业。
技术介绍
NQOl为体内一种重要的醌氧化还原酶，通过去电子还原反应参与机体内多种醌类化合物的代谢及醌类药物的生物激活过程。NQOl在肿瘤细胞中高表达，而在正常细胞内表达很低，是一个理想的抗肿瘤药物作用的新靶点。NQOl靶向的药物可以选择性杀死NQOl高表达的肿瘤细胞，其机制涉及ROS产生、DNA损伤、细胞凋亡等多个方面。丹参酮IIA与β -拉帕醌被证实均经NQOl活化发生生物激活，靶向NQOl发挥抗肿瘤作用。二者被选作用于研宄NQOl抗肿瘤活性的工具药物。CN 1631364Α公开了丹参酮II A在制备治疗动脉粥样硬化药、心肌梗死药及抗肿瘤药中的用途，发现丹参酮IIA安全无毒，药理作用强，有良好的药用前景；CN 104013633Α公开了丹参酮II A在制备治疗皮肤癌药物中的应用；CN103006669A公开了丹参酮IIA介导F0X01依赖途径抗肿瘤的机制，主要涉及丹参酮IIA通过F0X01依赖途径诱导人非小细胞肺癌细胞株Α549的细胞凋亡作用；CN 103961711A公开了 NAMPT抑制剂协同丹参酮IIA及β -拉帕醌治疗人非小细胞肺癌的应用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称辅酶I，英文名称nicotinamide adeninedinucleotide)，缩写NAD+，是一种转递质子的辅酶，参与多种细胞物质及能量代谢过程，并在呼吸链的电子传递过程中起到核心枢纽作用。NADH是它的还原形式。近年来多种研宄表明，NAD+不仅作为质子传递体参与细胞能量代谢与传递过程，更在维持细胞代谢活性、细胞应激抵抗和寿命延长等方面起到关键作用。例如，NAD+可作为ADP-核糖基供体参与DNA修复酶PARP的活化过程，进而影响DNA损伤应答；也可做为去乙酰化酶SIRTl的辅酶参与多种蛋白转录调控及转录后加工过程。细胞内NAD+水平的调控对决定细胞命运起重要作用。NAD+合成分为从头合成和补救合成两条通路，其中从头合成通路以色氨酸为源头物质进行合成，补救合成通路以NAD+代谢中间产物NAM为起始物质进行合成。CN 1264599A公开了NAD+在细胞保护药物中的应用，发现NAD +有抗氧化、抗衰老，保护细胞膜并预防细胞坏死和突变的作用；CN 103565818A公开了 NAD+在制备化疗药物盐酸阿霉素有道德肝脏损伤药物中的应用，发现NAD+可以有效防治阿霉素造成的肝脏损伤。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出以NQOl靶向的抗肿瘤药物(以丹参酮IIA和β -拉帕醌为例)作为NAD+合成通路抑制剂在肿瘤治疗中的应用。本专利技术所涉及的药物丹参酮IIA及β -拉帕醌为药效明确的抗肿瘤药物，以NQOl为靶点，可以选择性杀死NQOl高表达的肿瘤细胞，被选定为研宄NQOl抗肿瘤作用的工具药物。专利技术中阐释了 NQOl靶向药物作为NAD+合成抑制剂发挥抗肿瘤作用的应用，发现NQOl靶向药物可以通过抑制氨基酸转运体LATl的表达，阻断NAD+从头合成来源物质色氨酸的转运，致使NAD+合成受阻，NAD +及NAD +合成通路中相关代谢产物水平降低。【附图说明】图1:A.丹参酮IIA时间依赖性抑制氨基酸转运体LATlmRNA表达；Β.β -拉帕醌时间依赖性抑制氨基酸转运体LATlmRNA表达；图2:Α.丹参酮IIA时间依赖性抑制氨基酸转运体LATl蛋白表达；Β.β -拉帕醌时间依赖性抑制氨基酸转运体LATl蛋白表达；图3:免疫荧光实验结果显示，丹参酮IIA及β -拉帕醌降低细胞膜上LATl的表达量;图4:Α.丹参酮IIA抑制色氨酸转运；Β.β -拉帕醌抑制色氨酸转运；图5:Α.丹参酮IIA时间依赖性诱导NAD+水平下调；Β.β -拉帕醌时间依赖性诱导NAD+水平下调；图6:Α.丹参酮IIA时间依赖性降低NAD+合成通路相关中间代谢产物的水平；B.β -拉帕醌时间依赖性降低NAD+合成通路相关中间代谢产物的水平。【具体实施方式】以下几个实施例，阐述本专利技术的抗肿瘤用途，但并不表示实施例对本专利技术的限制。实施例1.PCR实验实验材料:人非小细胞肺癌细胞Α549细胞购自ATCC，于37°C，5% 0)2条件下常规培养，培养基为含 10%小牛血清(PAA)的 RPM1-1640 (Gibco);胎牛血清(Fetal bovine serum)购于Hyclone (Logan, Utah，USA);膜蛋白酶(Trypsin)购于 Amersco (Solon，Oh1, USA);青霉素、链霉素、二甲基硫代二苯基四噻唑(MTT)、GAPDH抗体均购于南京生兴生物工程公司(江苏)Jrizol 总 RNA 提取试齐IJ、RT-PCR 试剂盒、Real-time PCR Master Mix(SYBR Green)购自Takara (大连宝生物)。实验方法:A549细胞接种于6孔板，给药丹参酮IIA 40 μ M或β -拉帕醌5 μ Μ，处理时间分别为0h，15min，30min，lh，2h。每I X 16细胞中，加入ImL Trizol，用ImL移液器反复吹打至液体澄清且无细胞团块，转移入1.5mL EP管中，按照Takara总RNA提取试剂盒操作提取总RNA，并进行RNA定量。按照RT-PCR试剂盒将mRNA逆转录为cDNA，按照Thermal CyclerDiceTM Real Time System(TaKaRa Code:TP800)使用说明书要求进行PCR试验操作。定量PCR反应条件:Stage 1:预变性:95°C，30secStage 2:PCR 反应:95°C，5sec ;60°C，15sec ;72°C，30sec ;45CyclesStage 3:融解曲线分析:95°C 15sec ；70°C 15sec。采用Livak法半定量分析RT-PCR检测结果。实施例2.Western Blot 实验A549细胞接种于6孔板，培养生长密度至85%，给予40 μ M丹参酮IIA或β-拉帕醌5 μ M处理，处理时间分别为Oh，15min，30min，lh，2h。PBS洗涤细胞一次后，置于冰板上，用细胞刮子将细胞刮下收集，8000rpmX Imin离心得到细胞沉淀，每20 μ L细胞压积中加入100 μ L RIPA细胞裂解液，冰上裂解30min后，超声破碎5次，每次2s，15000rpmX 1min离心得到上清即为提取到的总蛋白样品。BCA法测定蛋白含量。蛋白样品按体积比3:1加入上样缓冲液并煮沸5min。制备10% SDS-PAGE，对样品进行电泳分离。电泳分离后，进行湿电转移，将蛋白转至PVDF膜。PVDF膜在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中封闭Ih后，4°C孵育一抗过夜，兔二抗室温孵育lh，ECL显影，B1-Rad凝胶成像仪成像。实施例3.LC-MSn检测细胞内色氨酸、NAD +及NAD +合成中间代谢产物水平A549细胞接种至6孔板，培养生长密度至85%，给予40 μ M丹参酮IIA或β-拉帕醌5 μ M处理Oh，15min，30min，lh，2h。每样取200 μ I培养基，加入Iml含50ng/ml 2-氯腺苷(内标本文档来自技高网...
【技术保护点】
NQ01靶向药物作为NAD+合成通路抑制剂及其在抗肿瘤中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王广基，郝海平，刘慧颖，李清然，程学芳，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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