一种欧洲鳗鲡肝脏细胞系及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种欧洲鳗鲡肝脏细胞系及其构建方法和应用，属于海水鱼类细胞培养技术领域，该细胞系于2014年12月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为CCTCC NO:C2014239。本发明专利技术所述的欧洲鳗鲡肝脏细胞系为成纤维样细胞，能连续传代60代以上，且冻存复苏后贴壁良好，生长稳定，能直接用于水产病毒学、欧洲鳗鲡细胞生物学特性及免疫抗病基因功能的研究，并已被证实对鳗鲡疱疹病毒敏感。本发明专利技术的构建方法简便易行，重复性强，成本适中，也适用于其他欧洲鳗鲡细胞系的制备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种欧洲鳗鲡Anguilla)肝脏细胞系及其构建方法和应用，属于海水鱼类细胞培养

技术介绍
鱼类细胞培养始于20世纪60年代，自Wolf等1962年建立第一个真骨鱼类永久性细胞系——虹鳟生殖腺细胞系RTG-2以来，国内外已建立了 250余株鱼类细胞系，有40余种病毒采用细胞培养分离成功，鱼类胚胎干细胞培养的成功更是有力地促进了基因工程的发展。鱼类研究实验对于养殖场所、设备和水体环境的维持有较高的要求，以鱼类培养细胞作为实验模型，有着活体鱼无法比拟的优点:(I)成本低，细胞系的维护不需要大型的养殖设备和大量的换水与充气；(2)重复性好，实验条件可以精确控制；(3)取样、观测简便易行，利于进行大量样本的分析。鱼类体细胞系模型研究几十年来发展迅速，已经广泛应用于病原学、药理学、生理学、环境毒理学、细胞生物学、肿瘤学以及资源保护等各方面，在病毒学研究中尤其具有重要的地位，被视为病毒性病原分离、鉴定和特性研究的基础。鳗鲡养殖业是我国水产业重要的支柱行业，其年产量约占世界总产量的2/3，单项产品出口值在水产品中位居榜首。欧洲鳗鲡(AnguiIla AnguiIla)属鳗鲡目 鳗鲡科鳗鲡属{Anguilla)，原产于大西洋，于 1993 年首次引入我国，并于同年实现配套饲料国产化；自引养成功以来，欧鳗养殖业迅速发展，90年代末欧洲鳗鲡年产量超过日本鳗鲡，成为我国最重要的养殖鳗鲡品种，其肉质细嫩，味美，富含蛋白质、多种维生素及不饱和脂肪酸，具有极高的营养价值，有“软黄金”之称。由于养殖业的迅速发展，养殖布局不合理、密度过大、水流不畅等问题普遍发生，加之时有投喂变质饵料和滥用药物的状况，导致鱼体免疫力下降和水体污染，各类病害频繁爆发，其中不乏病毒性病例，而当前已有的欧洲鳗鲡细胞系模型极少，远不能满足研究需要。由于欧洲鳗鲡降河洄游的繁殖习性和复杂多变的生活史，其人工繁殖至今仍是未解的世界级技术难题；而欧鳗胚胎和低龄幼体的难以获取，和被列为濒危物种后对玻璃鳗进出口的限制，客观上增大了欧洲鳗鲡体细胞系建立的难度，更加突显出这一亟需填补的技术空白的重要性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，以弥补现有技术和细胞模型库的不足，并满足对欧洲鳗鲡进行病原学分析和生理特性、功能基因组等研究的应用需要。本专利技术所涉及的欧洲鳗鲡肝脏细胞系的构建方法，其步骤如下: 1)欧洲鳗鲡的试前准备:健康欧洲鳗鲡幼体黑仔鳗在洁净海水中于室内暂养I?2周，期间不喂食饵料； 2)欧洲鳗鲡肝脏组织的获取:将步骤I)准备好的仔鳗置于碎冰中行冰冻麻醉，至鱼体对物理刺激应激行为消失为止；以2%碘酊棉球充分擦拭鱼体表面去除黏液后，再以75%酒精棉球擦拭鱼体表面2?3次，由侧面剪开体壁，取出肝脏组织，置于(TC预冷并含青霉素及链霉素双抗的灭菌无钙镁D-Hanks平衡盐溶液中，清洗5?6次； 3)原代培养:将步骤2)得到的欧洲鳗鲡肝脏组织剪碎成0.5mm3?Imm3大小的组织块，以步骤2)所述灭菌无钙镁D-Hanks平衡盐溶液漂洗；用不含血清的L-15培养基润湿培养瓶底面，将漂洗后的组织块移入25mL培养瓶中，以0.3cm?0.5cm的间距均匀排列；倒置瓶身于20°C密闭培养6?8小时使组织块贴壁后，在培养瓶中加入原代及早期传代培养用完全培养液，缓慢翻正瓶身，使培养液浸润组织块，于20°C恒温下启动原代培养； 4)早期传代培养:收集生长良好的原代培养物进行早期传代培养，传代前弃去培养液和脱落的组织块，用0.25%胰酶润洗细胞层，弃去，再加入0.25%胰酶消化细胞，待细胞呈收缩分离态势时弃去胰酶，加原代及早期传代培养用完全培养液中止消化，以弯头滴管吹打培养物至细胞和组织块大部分分散脱落，收集细胞和组织悬浮液，100rpm离心3分钟，去除上清后用完全培养液重悬沉淀，依照细胞和组织块数量以1:1?2:1的比例在27°C下进行富集化培养，重复以上步骤直至确认培养物连续数代无污染迹象，传代后细胞能顺利形成铺满瓶底的单层； 5)常规传代培养:细胞能稳定形成单层后对其进行常规传代培养，以显微镜法对培养细胞进行连续观察，当细胞出现均匀的轻微堆叠现象时即行传代，用0.25%胰酶润洗细胞层，弃去，再加入0.25%胰酶消化细胞30秒至I分钟，待上层细胞收缩变圆时弃去胰酶，力口入常规传代培养用完全培养液，用弯头滴管轻柔吹打至上层细胞脱落制成细胞悬液，将全部细胞悬液移入新瓶，于27°C恒温下进行常规传代培养； 6)细胞的冻存及复苏:当细胞进入常规传代培养阶段后，对其分批进行液氮冷冻保存，冻存液组成为70%L-15、20%胎牛血清以及10%DMS0 ;复苏细胞时，以37°C水浴迅速解冻样品，吸出细胞悬液后与常规传代培养用完全培养液混匀接种于培养瓶内，12小时后更换培液，去除未成活细胞和DMSO成分后继续培养。步骤3)和4)所述原代及早期传代用完全培养液是以L-15培养基为基础，含终浓度为15%的胎牛血清，终浓度为200U/mL的青霉素，以及终浓度为200 μ g/mL的链霉素的完全培养液。步骤5)所述常规传代培养用完全培养液是以L-15培养基为基础，含终浓度为10%的胎牛血清，不含抗生素及其他营养添加物的完全培养液。本专利技术的各步骤中所用的百分比为体积百分比。根据上述细胞系构建方法，建立了一株欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL，该细胞系于2014年12月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为CCTCC N0:C2014239o所述欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL，该细胞系具有以下生物学特性: O该细胞系为典型的成纤维细胞形态，在体外连续传代60代仍可保持该形态特征。2)该细胞系增殖能力强，存活时间长，在每周更换培养基一次的条件下体外生存期限可稳定达到70?90天，最长可超过150天，在体外连续传代60代仍然保持该生理特征。本专利技术还保护了所述的欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL作为水产动物病毒宿主细胞的应用，取对数生长期的EL细胞，在维持性培养基环境下接种鳗鲡疱疹病毒HVA-1I，可产生典型的细胞病变(cytopathic effect , CPE)现象。所述维持性培养基以L-15培养基为基础，包含终浓度为2%的胎牛血清。本专利技术的有益效果在于: 1)本专利技术的技术方案简便易行，筛选条件简单明晰，所用试剂均为鱼类细胞培养中最常用的常规用品，无须添加任何特殊营养成分，从而保证了所构建的欧洲鳗鲡肝脏细胞系有广阔的应用空间，有效填补了欧洲鳗鲡体细胞系模型建立的技术空白； 2)所构建的欧洲鳗鲡肝脏细胞系(EL)细胞生长旺盛，形态均一，为成纤维样细胞，能连续传代60代以上，且冻存复苏后贴壁良好，生长稳定，能直接用于水产病毒学、欧洲鳗鲡细胞生物学特性及免疫抗病基因功能的研究，并已被证实对鳗鲡疱疹病毒敏感； 3)该构建方法操作简单，重复性强，成本适中，也适用于其他欧洲鳗鲡体细胞系。【附图说明】图1:欧洲鳗鲡肝脏细胞原代培养光镜照片:a&b、不同类型细胞从组织块中迁出；c&d、细胞围绕组织块形成不同形态的生长晕。图2:欧洲鳗鲡肝脏细胞传代培养光镜照片:a、第2代EL细胞；b、第5代EL细胞；C、第11代EL细胞；d、第21代EL细胞；e、第41代EL细胞；f、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL，该细胞系于2014年12月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为CCTCC NO:C2014239。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑在予，杨金先，龚晖，葛均青，林天龙，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35