由人羊水来源的细胞生成功能性的和持久的内皮细胞制造技术

本申请涉及由羊膜细胞可重复地产生大量内皮细胞的方法。本申请还公开了根据本申请的方法产生的内皮细胞以及利用这些细胞的治疗方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由人羊水来源的细胞生成功能性的和持久的内皮细胞相关申请的交叉引用本申请要求2012年5月30日提交的美国临时申请61/653,185和2012年10月4提交的美国临时申请61/709,431的优先权，此二者的全部内容通过引用并入本申请。关于联邦政府资助的研究或开发的声明本专利技术在由国家心肺和血液研究所授予的编号为R01HL097797的政府支持下进行。政府对本专利技术拥有一定的权利。专利
本专利技术涉及产生功能性的和持久的内皮细胞的方法。具体地，本专利技术涉及通过强制表达ETS-TF并与TGFβ信号通路的抑制相结合重编程羊膜细胞(AC)以从AC中产生大量真正的内皮细胞。
技术介绍
从容易获得的非血管细胞来源产生和扩增人内皮细胞(EC)对缺血和损伤器官的血管重建具有很大的治疗潜力。然而，目前还没有实现临床相关规模并同时保持其血管生成特征的稳定的EC的培养和扩增。成人来源的EC具有有限的扩增潜力并且在几代后就开始衰老。类似地，人胚胎干细胞(hESC)和诱导性多能干细胞(iPSC)来源的EC具有有限的增殖能力并且表型不稳定，其在连续传代后经常会转变成其他非血管谱系(JAMES等，NatBiotechnol,28:161-166(2010))。当在汇集的富含血小板的血浆中生长时(REINISCH等，Blood,113:6716-6725(2009))，来源于内皮祖细胞(EPC)的人EC(LYDEN等，NatMed,7,1194-1201(2001)；RAFII等，NatMed9:702-712(2003)；RAFII等，NatRevCancer,2:826-835(2002)；JIN等，NatMed,12:557-567(2006))及其后代内皮集落形成细胞(ECFC)显示出显著的增殖潜能(INGRAM等，Blood,104:2752-2760(2004)；YODER等，Blood,109:1801-1809(2007))。然而，EPC和ECFC是否能够维持其血管稳定性，以使得这些细胞增殖到临床规模仍是未知的。这些基于成人和hESC策略的不足之处可能是因对建立和维持EC一致性所必须的转录因子和微环境信号以及培养条件的认识不足所致。已发现转录因子(TF)E-26(ETS)家族的一些成员，包括ETV2(LEE等，Cellstemcell,2:497-507(2008)；SUMANAS等，Blood,111:4500-4510(2008))、FLI1(LIU等，CurrentBio.18:1234-1240(2008))和ERG(MCLAUGHLIN等，Blood,98:3332-3339(2001))参与调节血管发育和血管生成(DEVAL等，DevCell,16:180-195(2009)；SATO等，CellStructFunct,26:19-24(2001))。这些TF直接调节与EC的发育和功能相关的基因的表达。成人的EC组成性表达一些ETS因子，如FLI1、ERG(亚型1和2)、ETS1、ETS2、Elf1、Elk1、VEZF和ETV6，而ETV2是在胚胎发育过程中瞬时表达且在成人EC中不存在的(KATAOKA等，Blood,118:6975-6986(2011)；LELIEVRE等，TheInternationalJournalOfBiochemistry&CellBiology,33:391-407(2001))。尽管这些TF中的多种在血管特化中发挥重要作用(LIU等，CircRes,103:1147-1154(2008)；PHAM等，DevBiol,303:772-783(2007))，但是尚不知晓这些EC特异性TF是否也能够在非血管细胞中开启内皮基因。人羊水来源的细胞(AC)是可能适合于重编程为真正的EC的非血管细胞的潜在来源。出于诊断目的，会常规培养来自于妊娠中期的人胎儿羊水的新鲜分离的AC，所述AC来自于具有广泛的遗传和种族背景的个体。其显示出较高的增殖潜能，可以是HLA类型的、冻存的和公开留存用于临床应用的。AC可以变成各种细胞类型，包括内皮细胞、间叶细胞和神经细胞(DECOPPI等，Naturebiotechnology,25:100-106(2007)；Prusa和Hengstschlager,MedSciMonit,RA253-7(2002))。一种罕见的亚类c-Kit+(CD117+)AC，占AC群的0.2至2％，其代表多能的羊水干细胞(AFS)(ARNHOLD等，StemCellsInt2011,715341(2011)；DECOPPI等，Naturebiotechnology,25:100-106(2007))，其可以变成各种细胞类型，包括上皮细胞、间叶细胞和神经细胞。尽管据信这些c-Kit+细胞中的一些表达多能性Oct-4基因(DECOPPI等，Naturebiotechnology,25:100-106(2007)；PRUSA等，HumReprod,18:1489-1493(2003))，但是不清楚这些细胞是真正的多潜(pluripotent)还是主要专能细胞(multipotent)。事实上，认为大部分的AC是谱系定向细胞。已鉴定得到三个谱系定向AC的亚类：上皮样的(E-类型)、羊水(AF-类型)和成纤维细胞样的(F-类型)(BOSSOLASCO等，CellRes,16:329-336(2006))。据推测E-类型AC来源于胎儿的皮肤，而F-类型来源于结缔组织(Gosden,1983；Hoehn和Salk,1982)。已在对AC是否能够产生血管细胞进行了研究。在使血管生成的培养条件下孵育天然的人AC或预先选择的c-Kit+AC导致EC样细胞的产生和生长，所述EC样细胞表达一些EC特异性标记物，包括VE-钙粘蛋白、VEGFR2和CD31，并且其能够被重塑成管样结构(ENAVIDES等，TissueEngPartA,(2012)；DECOPPI等，Naturebiotechnology,25:100-106(2007)；KONIG等，Stemcellsanddevelopment,21:1309-1320(2012)；HANG等，Stemcellsanddevelopment,18:1299-1308(2009))。然而，这些EC样细胞具有较低的增殖潜能，其不表达完整的成熟EC基因库，并且也没有确证其原始的AC特征已被去除。因此，不能将这些细胞视为是真正的血管内皮细胞。专利技术概述根据本专利技术已发现在羊膜细胞(AC)中表达ETS-TF并与TGFβ信号通路的抑制相结合将AC重编程为增殖性的稳定的血管EC群，其称为rAC-VEC(“羊膜细胞重编程产生的血管内皮细胞”)，所述细胞具有形成灌注脉管系统和在体内移植进入肝窦内皮的能力。因此，本专利技术提供了从羊膜细胞中可重复地产生大量内皮细胞的方法。本申请还提供了根据本专利技术的方法工艺产生的内皮细胞以及利用这些细胞的治疗方法。在一个方面，本专利技术涉及在存在TGFβ信号抑制剂的情况下，在转录因子ETV2、FLI1和ERG(如ERG1或ERG2)在所述羊膜细胞中表达的条件下，通过培养AC由AC产生内皮细胞的方法。在一个实施方式中，在ETV2在羊膜细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生内皮细胞的方法，所述方法包括获得羊膜细胞；和在存在TGFβ信号抑制剂的情况下，在转录因子ETV2、FLI1和ERG在所述羊膜细胞中表达的条件下，培养所述羊膜细胞，从而获得内皮细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.30 US 61/653,185;2012.10.04 US 61/709,4311.一种产生血管内皮细胞的方法，所述方法包括在存在TGFβ信号抑制剂的情况下，在外源性引入的转录因子ETV2、FLI1和ERG在羊水细胞中表达的条件下，培养所述羊水细胞，从而获得内皮细胞，其中所述羊水细胞在前13-15天表达ETV2，且其中所述TGFβ信号抑制剂在前20-21天存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述羊水细胞中ETV2的表达是瞬时的，并且FLI和ERG的表达是组成性的。3.根据权利要求1所述的方法，其中用载体转导所述羊水细胞，所述载体包含编码转录因子ETV2、FLI1和ERG的核酸以实现所述转录因子的表达。4.根据权利要求1所述的方法，其中将编码所述转录因子的mRNA递送至羊水细胞以实现所述转录因子的表达。5.一种产生血管内皮细胞的方法，所述方法包括在存在TGFβ信号抑制剂的情况下，将所述转录因子ETV2、FLI1和ERG以多肽形式递送至羊水细胞，培养所述羊水细胞，从而获得内皮细胞，其中所述ETV2在前13-15天存在，且其中所述TGFβ信号抑制剂在前20-21天存在。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述TGFβ信号抑制剂是Ι型TGFβ受体的特异性抑制剂。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抑制剂是多肽，所述多肽包含I型TGFβ受体的可溶性形式、针对Ι型TGFβ受体或配体的抗体或小分子化合物。8.根据权利要求7所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·拉菲，S·Y·拉博尼，M·金斯伯格，
申请(专利权)人：康奈尔大学，
类型：发明
国别省市：美国;US