用于生产腺伴随病毒的细胞系制造技术

本发明专利技术涉及在无动物组分的悬浮条件下生长的HEK293细胞系。该细胞系对于腺伴随病毒（AAV）的快速和可扩大生产是理想的，并且支持所有AAV的血清型和嵌合体的生产。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产腺伴随病毒的细胞系相关申请本申请要求于2011年10月28日提交的美国临时申请号61/552,492的权益。本申请的完整内容全部通过引用并入本文。专利
本专利技术涉及在无动物组分的悬浮条件下生长的HEK293细胞系。该细胞系对于腺伴随病毒（AAV）的快速和可扩大生产是理想的，并且支持所有AAV血清型和嵌合体的生产。专利技术背景重组腺伴随病毒（rAAV）载体已证实在体内具有很少毒性和炎症至无毒性和炎症的转导和长期基因表达。AAV的这些独特特征已导致其公认为用于基因治疗应用的主导载体候选物。许多利用AAV的I期和II期临床试验已在全世界执行（Aucoin等人，Biotechnol.Adv.26:73（2008）；Mueller等人，GeneTher.15:858（2008））。然而，许多临床前研究和成功的临床试验已证实仍需要解决以支持rAAV的人基因治疗使用的许多挑战（Mueller等人，GeneTher.15:858（2008））。一个主要挑战是依照现代优良生产实践（cGMP）建立大规模制造技术，以获得扩展的临床需要所需的纯化载体数量。生成可扩大生产技术的成功在很大程度上依赖理解AAV关于生成试剂的基础生物学，例如细胞系、质粒或重组病毒载体等，当一起使用时，其将密切模拟野生型AAV生产。AAV已分类为细小病毒科中的依赖病毒属，因为它需要与辅助病毒例如腺病毒（Ad）或单纯疱疹病毒（HSV）一起共感染用于细胞培养中的生产性感染(productiveinfection)（Atchison等人，Science149:754（1965）；Buller等人，J.Virol.40:241（1981））。细小病毒在最小的DNA动物病毒中，具有完全由蛋白质和DNA构成的直径大约25nm的病毒粒子。AAV基因组是含有4679个碱基的线性、直链DNA分子（Srivastava等人，J.Virol.45:555（1983））。野生型（wt）AAV基因组由两个基因构成，所述两个基因分别编码四种复制蛋白质和三种衣壳蛋白质，并且在任一端上侧翼为反向末端重复（ITR）（Lusby等人，J.Virol.4:402（1980）；Srivastava等人，J.Virol.45:555（1983））。ITR是基因组复制和包装到衣壳内所需的唯一顺式作用元件。四种复制蛋白质（Rep78、68、52和40）是多功能的，并且在受感染细胞的核内的转录、病毒DNA复制和DNA包装到预形成的病毒衣壳内起作用（Chejanovsky等人，Virology173:120（1989）；King等人，EMBOJ.20:3282（2001））。病毒衣壳由分别以1:1:8比的三种蛋白质Vp1、Vp2和Vp3构成。衣壳蛋白质由相同可读框（ORF）产生，但利用不同的翻译起始位点。因为ITR是基因组复制和包装所需的唯一顺式作用元件，所以rep和cap基因可被移出且克隆到单独的质粒内，而无功能中的丧失。启动子和由启动子驱动的目的基因随后可克隆在ITR之间。因此，侧翼为ITR的任何基因可有效包装到AAV衣壳内，只要基因组大小小于5.0kb（Dong等人，Mol.Ther.18:87（2010）；Grieger等人，J.Virol.79:9933（2005）；Wu等人，Mol.Ther.18:80（2010））。然而，AAV仍缺乏复制的能力。AAV的鲜明特点之一是需要与辅助病毒例如Ad或HSV一起共感染。rAAV的生成习惯于需要载体和包装构建体转染到受Ad感染的细胞内（Muzyczka，Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:97（1992））。在与Ad或HSV一起共感染后，AAV利用几种辅助病毒早期基因以促进其自身复制。Ad感染到生产细胞内以生成rAAV在生产rAAV中是有效的，但后果是它还产生过于充足的Ad颗粒。Ad的完全去除已依赖物理技术例如CsCl梯度、柱层析和热变性步骤，以灭活可能仍存在的任何残留Ad颗粒。虽然这些操作中的大多数已在不同程度上成功，但Ad污染的可能性是不必要的风险，并且Ad变性蛋白质的存在对于临床使用是不能接受的。rAAV生产发展中的显著改进是三重质粒转染(tripleplasmidtransfection)的引入（Xiao等人，J.Virol.72:2224（1998））。该方法使用rep和cap质粒以及ITR质粒的变化，但消除Ad感染的使用。将E1A、E1B、E4和E2A的Ad蛋白质以及VARNA克隆到称为XX680的单个质粒内。在XX680质粒上供应Ad辅助基因消除在受转染细胞中的Ad生产，仅获得rAAV载体。三重转染方法仍是使用rAAV的大多数实验室实验中的标准生产方法。然而，该方法已受限于贴壁细胞的使用。rAAV生产中的进展已在过去10年中取得，所述进展已允许大量实验室抛弃使用贴壁HEK293细胞的生产，并且转向可扩大技术例如通过使用下述的基于感染的技术：重组腺病毒（Gao等人，Mol.Ther.5:644（2002）；Gao等人，Hum.GeneTher.9:2353（1998）；Liu等人，Mol.Ther.2:394（2000）；Liu等人，GeneTher.6:293（1999）；Tessier等人，J.Virol.75:375（2001））、单纯疱疹病毒（Booth等人，GeneTher.11:829（2004）；Conway等人，GeneTher.6:986（1999）；Hwang等人，Mol.Ther.7:S14（2003）；Kang等人，GeneTher.16:229（2009）；Thomas等人，Hum.GeneTher.20:861（2009））、杆状病毒表达载体系统（BEVS）（Aslanidi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA106:5059（2009）；Cecchini等人，GeneTher.15:823（2008）；Kohlbrenner等人，Mol.Ther.12:1217（2005）；Negrete等人，Meth.Mol.Biol.433:79（2008）；Negrete等人，J.GeneMed.9:938（2007）；Urabe等人，Hum.GeneTher.13:1935（2002）；Urabe等人，J.Virol.80:1874（2006））、和悬浮HEK293细胞的瞬时转染（Durocher等人，J.Virol.Meth.144:32（2007）；Hildinger等人，Biotechnol.Lett.29:1713（2007）；Park等人，Biotechnol.Bioeng.94:416（2006））。Park等人和Durocher等人证实使用其优化的无血清悬浮HEK293细胞生产系统分别生成大约1.4x104和3x104vg/细胞。这些研究共同的是下述事实：载体产率继续成为障碍，并且显著低于经由贴壁HEK293细胞转染和rHSV生产系统生成的vg/细胞。氯化铯纯化（CsCl）仍是最广泛使用的AAV纯化形式（Grieger等人，Nat.Protoc.1:1412（2006）；Grieger等人，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的HEK293细胞，其保藏为ATCC编号PTA‑13274。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.分离的HEK293细胞，其保藏为ATCC编号PTA-13274。2.生产AAV颗粒的方法，其包括：（a）向权利要求1的HEK293细胞提供AAV表达系统；（b）在其中产生AAV颗粒的条件下培养所述细胞；和（c）任选分离所述AAV颗粒。3.权利要求2的方法，其中所述细胞是悬浮培养的。4.权利要求2或3的方法，其中所述细胞在无动物组分的条件下培养。5.权利要求2或3的方法，其中步骤（c）包括从所述细胞中分离所述AAV颗粒。6.权利要求2或3的方法，其中步骤（c）包括从所述细胞在其中培养的培养基中分离所述AAV颗粒。7.权利要求2或3的方法，其中所述细胞在摇瓶中培养。8.权利要求2或3的方法，其中所述细胞在生物反应器中培养。9.权利要求2或3的方法，其中所述方法能够生产所有AAV的血清型、嵌合体和杂交物。10.权利要求2或3的方法，其中所述AAV选自AAV1、AAV...

【专利技术属性】
技术研发人员：J格里格，RJ萨穆斯基，
申请(专利权)人：北卡罗来纳查佩尔山大学，
类型：发明
国别省市：美国;US