一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用，所述载体是：1)将质粒pBBR1MCS-5中的rep基因启动子-35区“TTGACT”序列定点突变为“TTGACA”得到的质粒，或将所述质粒的rep基因启动子-10区“CATAAT”序列定点突变为“TATAAT”得到的质粒，或以上两处均定点突变得到的质粒；或2)以pBBR1MCS质粒为基础的、且具有相同的rep基因作为复制起始区的质粒发生与1)相同的定点突变所得到的质粒。该基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中具有更高的拷贝数，可用于在氧化葡萄糖酸杆菌中进行基因表达和未知功能基因的探索研究，尤其可用于高产基因工程菌的构建。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用
本专利技术涉及生物
，更具体地涉及一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用。
技术介绍
质粒作为应用最广泛的基因表达载体，可帮助外源基因转入受体细胞，并为其提供在受体细胞中的复制或整合能力及扩增与表达能力。质粒是细菌中一种独立于染色体之外的可自主复制的双链环状DNA分子，它含有独特的复制起始位点(ori)，有的还含有特定的复制子结构(replicon)，质粒的拷贝数与它的复制结构息息相关。氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)含有多种膜结合脱氢酶，可不完全氧化醇、醛等化合物生成相应的醛、酮和酸，其独特的不完全氧化特性使得它具有广泛的工业应用价值。利用基因重组技术在氧化葡萄糖酸杆菌中过表达脱氢酶基因，可在很大程度上增加单位质量菌体的酶活，提高相关产物的合成效率。目前，广泛用于G.oxydans基因表达的质粒主要是广宿主质粒pBBR1MCS系列，但是该质粒拷贝数较低。近来，少数研究者报导了基于广宿主质粒pBBR1MCS或G.oxydans内源性质粒而改造的质粒。例如，Verena等人将编码G.oxydans核糖体蛋白L35和L13的基因的启动子区域整合到广宿主质粒pBBR1MCS-2中，构建了强启动子载体pBBR1p264和中等强度启动子载体pBBR1p452，有利于满足不同程度蛋白表达水平的要求(参见VerenaKallnik,MariaMeyer,UweDeppenmeier,PaulSchweiger.ConstructionofexpressionvectorsforproteinproductioninGluconobacteroxydans.JournalofBiotechnology,2010,150:460-465.)。本专利技术人曾以G.oxydans内源性质粒pGOX3为基础，构建了基因表达质粒pZL1。该质粒包含了pGOX3中与质粒分配有关的par基因和与复制有关的rep基因，以及质粒PUC19的氨苄抗性基因和复制起始区origin，因而该质粒在大肠杆菌及氧化葡萄糖酸杆菌中均可自主复制(参见LinZhang,JinpingLin,YushuMa,DongzhiWei,MingSun.ConstructionofaNovelShuttleVectorforUseinGluconobacteroxydans.MolBiotechnol,2010,46:227-233.)。然而，这些质粒在G.oxydans中的拷贝数普遍较低，这大大限制了G.oxydans的工业应用潜能及科学研究进程。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用，从而解决现有技术中的质粒在氧化葡萄糖酸杆菌中的拷贝数普遍较低，导致氧化葡萄糖酸杆菌的工业应用受到限制的缺陷。为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：提供一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体，所述基因表达载体是：1)将质粒pBBR1MCS-5中的rep基因启动子-35区“TTGACT”序列定点突变为“TTGACA”序列得到的质粒(即将序列1689bp处的碱基T替换为碱基A得到的质粒)，或将质粒pBBR1MCS-5中的rep基因启动子-10区“CATAAT”序列定点突变为“TATAAT”序列得到的质粒(即将序列1707bp处碱基C替换为碱基T得到的质粒)，或以上两处均定点突变得到的质粒，其中，所述质粒pBBR1MCS-5序列如SEQIDNO：1所示；或2)其他以pBBR1MCS质粒为基础的、且与pBBR1MCS质粒具有相同的rep基因作为复制起始区的质粒发生与1)相同的碱基替换所得到的质粒。本专利技术所提供的基因表达载体以广泛用于氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌构建的质粒pBBR1MCS-5或以pBBR1MCS质粒为基础的衍生质粒为骨架，将其与复制有关的rep基因启动子的-35区和-10区分别突变为保守序列“TTGACA”和“TATAAT”，从而增强该启动子的强度，以增加rep基因的表达量，进而提高质粒的拷贝数。所述衍生质粒包括所有以pBBR1MCS质粒为基础的、且与pBBR1MCS质粒具有相同的rep基因作为复制起始区的质粒。这些衍生质粒可以是：pBBR1MCS-1、pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-3、pBBR1MCS-4、pEXGOX、pBBR1-p264、pBBR1-p452等等。由于这些衍生质粒均具有与pBBR1MCS质粒相同的rep基因，即与pBBR1MCS-5相同的rep基因作为复制起始区，因此在经过相同的定点突变后这些衍生质粒能实现与质粒pBBR1MCS-5经过相同的定点突变后的相同的技术效果。本专利技术还提供一种如上所述的适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体的应用，所述基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中能够有效表达同源基因或异源基因，尤其能够更有效地表达同源基因。所述同源基因可以是氧化葡萄糖酸杆菌膜结合葡萄糖酸-2-脱氢酶(ga2dh)基因，所述异源基因可以是绿色荧光蛋白(GFP)基因。本专利技术还提供了所述基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中表达氧化葡萄糖酸杆菌膜结合葡萄糖酸-2-脱氢酶基因的应用，以及绿色荧光蛋白基因的应用。所述基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中对膜结合葡萄糖酸-2-脱氢酶基因的有效表达还可用于2-酮基-D-葡萄糖酸高产基因工程菌的构建。还提供一种重组载体，所述重组载体通过如上所述的基因表达载体构建。还提供一种重组菌，所述重组菌含有如上所述的基因表达载体。本专利技术提供的基因表达载体通过在常用载体的基础上进行特定位点的突变，使其在氧化葡萄糖酸杆菌中的拷贝数得到明显提高。并且经证明该载体具有在氧化葡萄糖酸杆菌中能有效表达同源基因或异源基因的功能，与广泛应用于氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的载体pBBR1MCS-5质粒相比，本专利技术提供的基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中具有更高的拷贝数，可用于在氧化葡萄糖酸杆菌中进行基因表达和未知功能基因的探索研究，尤其可用于2-酮基-D-葡萄糖酸高产基因工程菌的构建。附图说明图1为实时定量PCR法测定质粒相对拷贝数的结果；图2为PCR扩增得到的启动子tufB的电泳图谱；其中，左边泳道为DNAMarker，分子标准从小到大依次为100bp，300bp，800bp，1500bp，2000bp，3000bp；右边泳道为tufB基因片段；图3为PCR扩增得到的ga2dh基因的电泳图谱；其中，左边泳道为DNAMarker，分子标准从小到大依次为300bp，500bp，800bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp；右边泳道为ga2dh基因片段；图4为各个重组菌与野生菌中ga2dh转录水平的比较；图5为各个ga2dh过表达菌催化葡萄糖酸钠(GA)的反应初速度的比较，即比较相同条件下反应2h后生成产物2KGA的浓度；图6为各菌在7L发酵罐中以GA为底物生产2KGA的过程比较；图7为PCR扩增得到的GFP基因的电泳图谱；其中，左边泳道为DNAMarker，分子标准大小从小到大依次为300bp，500bp，800bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp；右边泳道为GFP基因片段；图8为各表达GF本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体，其特征在于，所述基因表达载体是：1)将质粒pBBR1MCS‑5中的rep基因启动子‑35区“TTGACT”序列定点突变为“TTGACA”序列得到的质粒，或将质粒pBBR1MCS‑5中的rep基因启动子‑10区“CATAAT”序列定点突变为“TATAAT”序列得到的质粒，或以上两处均定点突变得到的质粒，其中，所述质粒pBBR1MCS‑5序列如SEQ ID NO：1所示；或2)以pBBR1MCS质粒为基础的、且与pBBR1MCS质粒具有相同的rep基因作为复制起始区的质粒发生与1)相同的定点突变所得到的质粒。

【技术特征摘要】
1.一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体，其特征在于，所述基因表达载体是：将质粒pBBR1MCS-5中的rep基因启动子-35区“TTGACT”序列定点突变为“TTGACA”序列得到的质粒，或将质粒pBBR1MCS-5中的rep基因启动子-10区“CATAAT”序列定点突变为“TATAAT”序列得到的质粒，或以上两处均定点突变得到的质粒，其中，所述质粒pBBR1MCS-5序列如SEQIDNO：1所示。2.一种根据权利要求1所述的适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体的应用，其特征在于，所述基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中能够有效表达同源基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：林金萍，魏东芝，石园园，李克非，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31