使用合成的信使RNA无饲养细胞地衍生人类诱导性多能干细胞制造技术

本公开总的来说涉及使用工程化的重编程因子通过动力学受控过程产生诱导性多能干细胞(iPSC)的新方法和组合物。具体来说，本公开涉及建立被优化用于重编程各种不同类型细胞的重编程因子的组合，包括常规重编程因子与反式激活结构域之间的融合体。更具体来说，本文中公开的示例性方法可用于从各种不同的哺乳动物细胞类型、包括人类成纤维细胞产生诱导性多能干细胞。还公开了使用合成的信使RNA无饲养细胞地衍生人类诱导性多能干细胞的示例性方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用合成的信使RNA无饲养细胞地衍生人类诱导性多能干细胞相关申请本申请要求2012年5月13日提交的美国临时申请USSN61/646,292的优先权利益，其内容整体并入本文。专利
本公开总的来说涉及使用工程化的重编程因子通过动力学受控过程产生诱导性多能干细胞(iPSC)的新方法和组合物。具体来说，本公开涉及建立被优化用于重编程各种不同类型细胞的重编程因子的组合，包括常规重编程因子与反式激活结构域之间的融合体。更具体来说，本文中公开的示例性方法可用于从各种不同的哺乳动物细胞类型、包括人类成纤维细胞产生诱导性多能干细胞。还公开了使用合成的信使RNA无饲养细胞(feeder-free)地衍生人类诱导性多能干细胞的示例性方法。
技术介绍
下面包括了可用于理解本公开的各个方面和实施方式的信息。这并不是承认这里提供的任何信息是本文中描述或要求的专利技术的现有技术或与其相关，或者任何明确或隐含地参考的出版物或文献是现有技术。诱导性多能干细胞(iPSC)的治疗潜力，刺激了避开对体细胞进行遗传修饰以引起向多能状态的重编程的需要的重编程方法的开发尝试。就此而言获得成功的第一种“非整合”方法——蛋白质转导、质粒转染和腺病毒载体的使用，由于获得的iPSC转化的效率低而在应用上受限。更近些时候，已显示利用游离体DNA、仙台病毒和合成的信使RNA(mRNA)的技术，以与使用整合病毒载体所获得的效率可比或更高的效率产生“无足迹”iPSC。在原理上，RNA转染是这些方法中最具吸引力的，因为它对重编程因子(RF)表达的时间过程提供精确控制，同时完全避免了对“清除”重编程的细胞以除去载体的残留痕迹的任何需要。然而，基于mRNA的重编程的现有流程，由于在人类细胞中诱导多能性所需的～2周时间内需要每日进行重复转染，因此是相对劳动密集的。这些程序也依赖于饲养细胞的使用，为方法增添了复杂性和技术可变性，同时引入了具有非人类来源的(“外来的”)生物材料的潜在污染源。生产诱导性多能干细胞(iPSC)的主要难点是将分化的细胞重编程成多能细胞的低效率。以前已报道，当用由Oct4和MyoD的反式激活结构域构成的融合基因(被称为M3O)以及Sox2、Klf4和c-Myc(SKM)转导时，5％的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)被重编程成iPSC。此外，M3O在大多数被转导的MEF、包括没有变成iPSC的细胞中促进了多能性基因的染色质重塑。这些观察表明了在提供更有利的培养条件的情况下，超过5％的细胞获得了变成iPSC的能力的可能性。专利技术概述因此，为了应对这些缺点，本公开提供了用于产生干细胞的方法和组合物，所述干细胞能够产生人体的所有不同组织。在某些情况下，使用信使RNA分子并且不需病毒载体、动物产物或饲养细胞，本文公开的方法可用于将人类成纤维细胞重编程成诱导性多能干细胞(iPSC)。所述示例性方法和组合物的使用导致与以前报告的细胞重编程方法相比，效率惊人且出人意料地提高。因此，提供了通过改进重编程因子(RF)混合物，尤其是通过使用并入了已知的强转录因子例如VP16和MyoD的反式激活结构域的常规重编程因子例如Oct4(也称为Oct3/4)、Sox2等的工程化变体而可用于加速mRNA介导的重编程的方法、试剂和/或组合物。本文中公开的方法和组合物产生了无饲养细胞、无外来物的方案，其极大减少了基于mRNA的重编程中所涉及的时间、成本和工作量。一方面，本公开提供了一种用于去分化或重编程体细胞的方法，所述方法包括：a)用组合物转染分离的体细胞，所述组合物包含有效量的、任一种或多种合成的mRNA重编程因子与反式激活结构域之间的融合产物，由此将所述体细胞重编程或去分化，所述合成的mRNA重编程因选自Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Nanog和Lin28。在一种实施方式中，提供了一种权利要求1的方法，其中所述组合物包含融合到N-端MyoD反式激活结构域的Oct4。在一种实施方式中，所述Oct4被融合到采取串联三联体形式的N-端MyoD反式激活结构域。一方面，提供了一种使用权利要求1中的任一种或多种合成的mRNA重编程因子来重编程哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：a)以标准6孔板的每个孔25k至250k个细胞的密度在无饲养细胞表面中生长靶细胞；b)在重编程期间，每次用50ng至800ng/mlmRNA的不同剂量转染细胞。在一种实施方式中，以标准6孔板的每个孔50k、75k、100k或150k个细胞的密度在无饲养细胞表面中生长所述靶细胞；b)在重编程期间，每次用50ng至800ng/mlmRNA的不同剂量转染细胞，其中在较早时间点使用比较晚时间点更低的剂量；c)无需传代，获得iPSC。在一种实施方式中，以标准6孔板的每个孔50k、75k、100k或150k个细胞的密度在无饲养细胞表面中生长所述靶细胞，其中将每个孔的体积调整到相当于0.5ml至5ml之间的适当培养基：b)在重编程期间，每次用50ng至800ng/mlmRNA的不同剂量转染细胞，其中在较早时间点使用比较晚时间点更低的剂量；c)无需传代，获得iPSC。在一种实施方式中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。在一种实施方式中，所述方法是无外来物的。在一种实施方式中，所述一种或多种因子选自mRNA、调控RNA、siRNAmiRNA及其组合。在一种实施方式中，将所述体细胞用至少两种不同RNA转染。在一种实施方式中，所述体细胞选自单能、专能(multipotent)、多能和分化的细胞。在一种实施方式中，所述一种或多种RNA诱导所述体细胞去分化成单能、专能或多能细胞。在一种实施方式中，所述至少一种因子选自OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、KLF4和MYCmRNA。在一种实施方式中，所述OCT4、SOX2、NANOG和LIN28mRNA被组合给药。在一种实施方式中，所述OCT4、SOX2、KLF4和MYCmRNA被组合给药。在一种实施方式中，将所述被转染的细胞作为诱导性多能干(iPS)细胞维持在培养物中。在一种实施方式中，所述被转染的细胞形成诱导性多能干细胞，并且还包括诱导所述iPS细胞以形成分化的细胞。一方面，提供了一种在患者中治疗或抑制疾病或障碍的一种或多种症状的方法，所述方法包括将细胞在体外去分化，并将所述细胞给药于所述患者。在一种实施方式中，所述组合物还包含Rarg和LrH-1反式作用激活结构域。在一种实施方式中，所述组合物包含融合到VP16反式激活结构域的Oct4。本文描述和要求权利的本专利技术具有许多特性和实施方式，包括但不限于在本概述中提出或描述或指称的。它不打算是全包含性的，并且本文描述和要求权利的本专利技术不限于在本概述中认定的特点或实施方式或不受其限制，包含所述特点或实施方式仅仅是出于说明而不是限制的目的。其他实施方式可能公开在下面的详细描述中。附图简述图1.使用基于M3O的mRNA重编程混合物衍生的iPSC集落。(A)源自于第一次基于M3O的BJ重编程试验的两个扩增的iPSC克隆的10x亮视野图像。(B)扩增的克隆的多能性标志物的免疫染色。图2.使用基于M3O的混合物的无饲养细胞重编程。(A)免疫荧光成像示出了来自于50K个XFF成纤维细胞上的无饲养细胞衍生的TRA-1-60+集落产量，比较了基于c-M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于去分化或重编程体细胞的方法，所述方法包括：用组合物转染分离的体细胞，所述组合物包含有效量的、任一种或多种合成的mRNA重编程因子与反式激活结构域之间的融合产物，由此将所述体细胞重编程或去分化，所述合成的mRNA重编程因子选自Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Nanog和Lin28。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.13 US 61/646,2921.一种用于去分化或重编程无饲养细胞、无外来物且无整合的哺乳动物体细胞的方法，所述方法包括：a)用补充有以下组合物的培养基转染分离的哺乳动物体细胞，所述组合物包含：1)有效量的编码M3O的合成的mRNA，以及2)编码Sox2、Klf4、Nanog、Lin28和cMyc-T58A的合成的mRNA；并且b)在无饲养细胞和无外来物的培养条件下培养所述体细胞足够长的时间，并且每天重复步骤a)一次直到将所述体细胞重编程或去分化，产生无饲养细胞、无外来物且无整合的诱导的多能干细胞。2.一种用于去分化或重编程无饲养细胞、无外来物且无整合的哺乳动物体细胞的方法，所述方法包括：a.在培养基中将所述哺乳动物体细胞以一细胞密度铺板，所述细胞密度等同于标准6孔组织培养板的每个孔50,000至150,000个细胞，并在无饲养细胞、无外来物且无整合的条件下培养；b.在铺板后一天，通过将步骤a的培养基换成新鲜培养基来转染细胞，所述新鲜培养基补充有包含以下的组合物：1)有效量的编码M3O的合成的mRNA，以及2)编码Sox2、Klf4、Nanog、Lin28和cMyc-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继武，鲁吉·瓦兰，倪毓辉，
申请(专利权)人：美国绿阳生物技术及医药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US