本发明专利技术提供了一种荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂及其制备方法，属于生物药物制备领域。本发明专利技术的特异性前哨淋巴结显像剂是由Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Cy5.5-NHS)偶联的利妥昔单抗经过分离纯化后获得，缩写为Cy5.5-SLN-F。该显像剂使用方便、性能稳定，保存时间长，可达24个月，且标记率高达95％以上；可操作性强，可用于红外显像的前哨淋巴结的无创探测，次级淋巴结摄取低、注射点滞留低，显像及活检时间不受限，从注射后30min-24h都能很好显影，显影率达100％，具有更好的安全性，同时成本低，具有较好的临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了，属于生物药物制备领域。本专利技术的特异性前哨淋巴结显像剂是由Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Cy5.5-NHS)偶联的利妥昔单抗经过分离纯化后获得，缩写为Cy5.5-SLN-F。该显像剂使用方便、性能稳定，保存时间长，可达24个月，且标记率高达95％以上；可操作性强，可用于红外显像的前哨淋巴结的无创探测，次级淋巴结摄取低、注射点滞留低，显像及活检时间不受限，从注射后30min-24h都能很好显影，显影率达100％，具有更好的安全性，同时成本低，具有较好的临床应用前景。【专利说明】
本专利技术涉及生物制药领域，具体地，涉及。
技术介绍
手术是治疗乳腺癌的主要手段，由于腋窝淋巴结状态是影响乳腺癌病人生存的重要的独立性预后因子，临床上常用腋窝淋巴结清扫作为腋窝淋巴结状态诊断和治疗的一种手段，而单纯乳腺切除加腋窝淋巴结清扫(axillary lymph node dissect1n, ALND)是最常用的手术方式。随着乳腺癌的筛查和早期诊断，新发现的乳腺癌患者中50%?70%术后病理腋淋巴结阴性，对该部分患者施行ALND属于过度治疗；因此对所有乳腺癌患者均进行ALND的合理性受到质疑，迫切期待能够替代ALND的准确、微创的腋窝分期技术一乳腺癌前哨淋巴结活检(sentinel lymph node b1psy，SLNB)。SLN是乳腺癌淋巴转移的第一个淋巴结，可获得95%的诊断意义，并发症少。 SLNB由于能够提供较为准确的分期、减少传统手术并发症而成为研宄的热点之一，也是有望成为乳腺癌治疗的规范化手术式之一。在众多研宄中，选取的放射性示踪剂几乎都是依靠淋巴结吞噬作用进行探测的放射性胶体("mTc-硫胶体或99mTc-人血清白蛋白等)，其颗粒大小不均，次级淋巴系统有显影，每次注入示踪剂颗粒总数不易控制，且显像及活检时间要求高，否则均可导致非SLN显影，导致SLNB失败。2013年3月美国药监局(FDA)首次批准用于淋巴结定位的新药一Lymphoseek。它能够与淋巴网状内皮细胞表面甘露糖受体(mannose receptor,⑶206)特异性结合，精确检测原发肿瘤(乳腺癌、黑色素瘤)向淋巴转移情况。面对国外公司专利、技术保护的前提下，亟需发展新型特异性的淋巴结定位显像剂，以应对临床需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种使用方便、性能稳定、可操作性强且无核素辐射的荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂。 本专利技术的另一目的在于提供上述制备荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂的制备方法。 本专利技术提供的荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂，是由荧光物质偶联的利妥昔单抗经过分离纯化后获得。 具体地，本专利技术使用的荧光物质为Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Cy5.5-NHS)或Cy7-NHSo本专利技术实施例中使用Cy5.5-NHS。 本专利技术提供了制备荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂的方法，含有以下步骤: (I)纯化利妥昔单抗，并调配其浓度适合与荧光物质偶联； (2)在PBS缓冲溶液中使荧光物质与步骤(I)获得的利妥昔单抗充分偶联； (3)分离纯化偶联物。 本专利技术的上述方法中，步骤(I)纯化的方法为:通过凝胶色谱柱对利妥昔进行纯化。 本专利技术的方法中，步骤(I)采用PBS缓冲溶液调配纯化后的美罗华单抗浓度为5 ?lOmg/mL。 进一步地，所述PBS缓冲溶液浓度为0.01?0.1M，pH为6.0?8.0。优选地，pH 为 7.4。 其中步骤⑵的荧光物质为Cy5.5-NHS,其DMF溶液浓度为I X 10_2?I X 10 _3mol/mL。 其中，步骤(2)荧光物质与利妥昔单抗充分偶联的方法为:按照Cy5.5-NHS与美罗华单抗的体积比1:10?1:100将二者混合，并加入体积为Cy5.5-NHS体积10-100倍的0.1MpH = 6.0-8.0的PBS缓冲溶液，以lmol/L的Na2HPO4溶液调节反应体系的pH为8.0-9.5，充分混匀于4°C条件下避光反应12-24h。 优选地，步骤(2)荧光物质与利妥昔单抗充分偶联的方法为:按照Cy5.5-NHS与利妥昔单抗的体积比1:10将二者混合，并加入体积为Cy5.5-NHS体积100倍的0.1M pH = 7.4的PBS缓冲溶液，以lmol/L的Na2HPO4溶液调节反应体系的pH为8.5，充分混匀于4°C条件下避光反应12h。 本专利技术的方法中，步骤(3)采用ro-ιο柱分离纯化偶联物。 本专利技术还提供了上述特异性前哨淋巴结显像剂在制备乳腺癌检测试剂盒中的应用。 本专利技术提供的特异性前哨淋巴结显像剂具有以下优点:该显像剂使用方便、性能稳定，保存时间长，可达24个月，且标记率高达95%以上；可操作性强，可用于红外显像的前哨淋巴结的无创探测，次级淋巴结摄取低、注射点滞留低，显像及活检时间不受限，从注射后30min-24h都能很好显影，显影率达接近100 %，无任何放射性辐射，具有更好的安全性，同时成本低，具有较好的临床应用前景。 【专利附图】【附图说明】 图1为Cy5.5_SLN_F前哨淋巴结显像剂的偶联示意图。 图2为Cy5.5_SLN_F单抗在裸鼠的前哨淋巴结荧光显像图，由左及右共6个图片，分别是皮下注射Cy5.5-SLN-F 30min、6h、ld、2d、5d、9d后的小鼠前哨淋巴结荧光显像图。 【具体实施方式】 以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。 实施例1荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂的制备(I) I)⑶20靶向单抗的纯化(以利妥昔单抗为例):取1.0mL 10mg/ml的具有⑶20抗原靶向的单抗，加入预先处理的ro-10柱中，而后向其中加入0.0lM pH 7.4的PBS溶液，收集其中ImL的单抗。并通过生物学方法进行蛋白定量，并向其中加入0.0lM pH 7.4的PBS溶液，稀释到5mg/mL待用； 2)以 0.0lM pH 7.4 的 PBS 溶液为缓冲液，取浓度为 I X l(T2mol/mL 的 Cy5.5-NHS的DMF溶液10 μ L与上述0.1mL利妥昔单抗溶液混合，向其中加入ImL 0.1M PBS溶液(pH=7.4)，以lmol/L的Na2HPCM溶液调节反应体系的pH为8.0，充分混匀，于4°C条件下避光反应i2h。通过ro-1o柱分离纯化。获得可进行红外显像的特异性前哨淋巴结药物Cy5.5-SLN-Fο 实施例2荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂的制备(2) I) CD20靶向单抗的纯化(以利妥昔单抗为例):取1.0mL 50mg/ml的具有CD20抗原靶向的单抗，加入预先处理的ro-10柱中，而后向其中加入0.0lM pH 7.4的PBS溶液，收集其中利妥昔单抗。并通过生物学方法进行蛋白定量，并向其中加入0.1M pH 7.4的PBS溶液，稀释到10mg/mL待用； 2)以 0.1M pH 7.4 的 PBS 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂，其特征在于，由荧光物质偶联的利妥昔单抗经过分离纯化后获得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨志，朱华，刘菲，
申请(专利权)人：北京肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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