一种用于微纳颗粒对细胞影响实验的微反应器的制备方法技术

一种用于微纳颗粒对细胞影响实验的微反应器的制备方法，步骤是：(A)将细胞、微纳颗粒充分混匀于聚阴离子等渗溶液中形成混合液；(B)用静电微注射仪将混合液滴入盛有二价阳离子等渗溶液的收集池，得到包裹细胞和微纳颗粒的凝胶微球；(C)将B步的凝胶微球投入聚阳离子等渗溶液中，形成一层聚阳离子包覆膜；随后投入聚阴离子等渗溶液中振荡再形成一层聚阴离子包覆膜；重复操作0-3次，得到具有2-8层包覆膜的凝胶微球；(D)将(C)步的凝胶微球投入二价阳离子的等渗置换液，即获得用于微纳颗粒对细胞影响实验的微反应器。该微反应器使细胞-微纳颗粒充分接触，细胞、微纳颗粒的计量准确，能更准确、可靠地反映微纳颗粒对细胞的影响作用关系。

【技术实现步骤摘要】
一种用于微纳颗粒对细胞影响实验的微反应器的制备方法
本专利技术涉及一种用于微纳颗粒对细胞影响实验的微反应器的制备方法。
技术介绍
随着社会和经济的发展，环境问题愈来愈严重。空气中存在众多的微纳(微米、纳米尺度)颗粒，科学技术的发展已揭示环境中存在的PM2.5(粒径小于等于2.5微米的颗粒)严重地威胁人类的健康。PM2.5这种微纳颗粒如何引起细胞毒性及人体的病变成为人们普遍关注的问题。此外，利用微纳颗粒载药治疗各种疾病也成为研发热点。而微纳颗粒由于有较大的比表面积和较小的体积，其对细胞的影响和作用关系评价困难。通过将微纳颗粒置于培养板底部，随后加入细胞悬液，在37℃，5％CO2培养箱中共培养，同时在实验过程中，对细胞的形态、增殖、分化和细胞因子等相关特性进行检测，从而完成微纳颗粒对细胞影响的实验，以反映、评价微纳颗粒对细胞的影响和作用关系。但其普遍存在取样及检测困难的问题：1、取样过程中易引起细胞和微纳颗粒的损失，不能准确反映微纳颗粒对细胞作用的量效关系；2、细胞与密度较小的微纳颗粒共培养时，由于微纳颗粒密度小于液体培养基的密度，在共培养时微纳颗粒漂浮于培养基上方，无法与贴于培养板底部生长的细胞直接接触，从而影响细胞实验检测的结果。对此，有人提出将微纳颗粒与Ⅰ型胶原溶液在培养板中混合，待I型胶原溶液在室温下固化后，微纳颗粒粘于固化的I型胶原上方，再与细胞进行共培养，虽解决了微纳颗粒与细胞无法接触的问题；但是，微纳颗粒被固定于固化的I型胶原上表面后可能导致细胞的新陈代谢、活性、细胞间及微纳颗粒与细胞间信号传递受阻等问题，且部分微纳颗粒会存于固化的I型胶原内部，而无法与细胞接触，仍会导致实验的准确性不足。也有人提出倒置培养模型，即待细胞贴于培养板底部后，再加入微纳颗粒，并将培养板加满培养基，用封口膜将培养板覆盖，最后将培养板倒置。培养过程中细胞贴附于上方(倒置后的培养板底部)，而微纳颗粒会漂浮于培养基上方，即聚集于倒置后的培养板底部，该方法虽解决了微纳颗粒与细胞接触的问题，但操作难度大，换液困难，不能进行长期培养；且在需要分离培养基检测细胞的形态、增殖、分化和细胞因子的等相关特性时，微纳颗粒易被同时带出，也将影响微纳颗粒对细胞影响作用关系的检测结果。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种用于微纳颗粒对细胞影响实验的微反应器的制备方法，将该方法制备的微反应器置于培养基中，即可进行微纳颗粒对细胞影响的实验，实验时细胞-微纳颗粒充分接触，细胞和微纳颗粒的计量准确，能更准确、可靠地反映微纳颗粒对细胞的影响作用关系。本专利技术实现其专利技术目的所采用的技术方案是，一种用于微纳颗粒对细胞影响实验的微反应器的制备方法，包括以下步骤：(A)预处理：将106-109个实验用细胞和0.1-2.0g微纳颗粒充分混匀于5-50mL的1.0-5.0wt.％的聚阴离子等渗溶液中形成粘稠混合液；(B)凝胶体系构建：采用静电微注射仪将A步的粘稠混合液滴入盛有20-200mL的0.5-10.0wt.％二价阳离子等渗溶液的收集池；静置5-20min后，过滤除去上清液并用生理盐水洗涤得到包裹细胞和微纳颗粒的凝胶微球；(C)络和成膜：将凝胶微球投入0.1-1.5wt.％的聚阳离子等渗溶液中，振荡5-15min；聚阳离子在凝胶微球表面形成一层聚阳离子包覆膜；静置后，过滤除去上清液并用生理盐水洗涤；随后投入0.1-0.5wt.％的聚阴离子等渗溶液中振荡5-15min，再在凝胶微球表面形成一层聚阴离子包覆膜；静置后，弃去上清液并用生理盐水洗涤；重复以上操作0-3次，得到具有2-8层包覆膜的凝胶微球；(D)液化反应：将C步得到的具有2-8层包覆膜的凝胶微球投入二价阳离子的等渗置换液中振荡0.5-5min，等渗置换液的浓度为0.5-10.0wt.％，使凝胶微球中的二价阳离子被置换，聚阴离子与二价阳离子的交联结构破坏，静置后除去上清液并用生理盐水洗涤，即获得包裹细胞和微纳颗粒的、用于微纳颗粒对细胞影响实验的微反应器。本专利技术制得的微反应器的使用方法是：将微反应器置于培养基中即可进行微纳颗粒对细胞影响的实验：即将培养基及其微反应器在37℃，5％CO2培养箱中培养，培养过程中进行细胞的形态、增殖、分化和细胞因子相关特性检测，即可得出微纳颗粒对细胞的影响作用关系。实验环境为通常的细胞实验环境即十万级超净实验室或万级超净台。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：一、本专利技术通过将实验用细胞和微纳颗粒混匀于聚阴离子等渗溶液中形成粘稠混合液，采用静电微注射仪滴入二价阳离子等渗溶液中，由于静电场的作用，粘稠混合液在滴入二价阳离子等渗溶液前被分散成微米级的液粒，随后与等渗溶液中的二价阳离子交联形成包裹细胞和微纳颗粒的凝胶微球。即细胞和微纳颗粒全部被包裹在微米尺度的凝胶微球中，保证了细胞和微纳颗粒的计量准确。二、包裹细胞和微纳颗粒的凝胶微球含聚阴离子，可与聚阳离子等渗溶液中的聚阳离子通过聚电解质的静电吸附作用形成聚阳离子包覆膜；再置于聚阴离子等渗溶液中通过聚电解质的静电吸附作用形成聚阴离子包覆膜，多次重复得到包覆多层阴、阳离子膜结构的凝胶微球；最后凝胶微球球芯内的二价阳离子被置换，聚阴离子与二价阳离子的微球交联结构破坏，得到多层膜结构包裹的细胞和微纳颗粒共存的微米级球形腔的微反应器。微反应器的微米级球形腔将细胞和微纳颗粒共同局限在微反应器内狭小的三维空间内，既可以保护其中的细胞免于物理损伤，也能够实现细胞和微纳颗粒的互相充分接触。同时允许营养物质、氧气、废物的双向扩散，能够保证培养基自由进出；还可以满足细胞足够的生长空间，利于细胞生长代谢和稳定化，使细胞之间信号传递畅通，并有利于维持细胞活性；从而更真实地模拟人体或动物体内细胞与微纳颗粒的共存和接触环境，更可靠地反映微纳颗粒对细胞的影响作用关系。三、使用本专利技术的微反应器进行微纳颗粒对细胞影响的实验，选取的细胞和微纳颗粒能全部被包裹在微米级的凝胶微球中；共培养过程中，细胞和微纳颗粒均局限在微反应器内狭小的微米级球形三维空间内，培养(包括换液)过程中不会溢出和丢失；保证了细胞和微纳颗粒的计量准确，能准确地反映微纳颗粒对细胞影响的量效关系，其实验结果更精确、可靠。上述(A)步的聚阴离子是海藻酸钠、海藻酸钾、纤维素硫酸钠、聚丙烯酸钠或聚丙烯酸钾。以上聚阴离子资源丰富、毒性小、生物相容性好，使其得到广泛应用。上述(C)步的聚阳离子是壳聚糖、聚赖氨酸、聚烯丙基胺、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵或聚乙烯亚胺。以上聚阴离子生物相容性好、价格便宜，具有很大应用价值。上述(B)步的二价阳离子为钙离子、锰离子或锌离子。以上二价阳离子对细胞无毒无害，不会影响细胞生长。上述(D)步的二价阳离子的等渗置换液是柠檬酸钠等渗溶液、柠檬酸钾等渗溶液、乙二胺四乙酸(EDTA)等渗溶液或乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)等渗溶液。以上二价阳离子置换液对细胞无毒无害、价格便宜，与钙离子、锰离子或锌离子结合力强。上述(A)步的微纳颗粒为超高分子量聚乙烯微纳颗粒、纳米金颗粒、羟基磷灰石微纳颗粒、载药磷酸钙微纳颗粒、PM2.5、二氧化钛微纳颗粒或二氧化硅微纳颗粒。上述(B)步的静电微注射仪的外加电压为5-20kV。选择以上电压本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于微纳颗粒对细胞影响实验的微反应器的制备方法，包括以下步骤：(A)预处理：将106‑109个实验用细胞和0.1‑2.0g微纳颗粒充分混匀于5‑50mL的1.0‑5.0wt.％的聚阴离子等渗溶液中形成粘稠混合液；(B)凝胶体系构建：采用静电微注射仪将A步的粘稠混合液滴入盛有20‑200mL的0.5‑10.0wt.％二价阳离子等渗溶液的收集池；静置5‑20min后，过滤除去上清液并用生理盐水洗涤得到包裹细胞和微纳颗粒的凝胶微球；(C)络和成膜：将凝胶微球投入0.1‑1.5wt.％的聚阳离子等渗溶液中，振荡5‑15min；聚阳离子在凝胶微球表面形成一层聚阳离子包覆膜；静置后，过滤除去上清液并用生理盐水洗涤；随后投入0.1‑0.5wt.％的聚阴离子等渗溶液中振荡5‑15min，再在凝胶微球表面形成一层聚阴离子包覆膜；静置后，弃去上清液并用生理盐水洗涤；重复以上操作0‑3次，得到具有2‑8层包覆膜的凝胶微球；(D)液化反应：将C步得到的具有2‑8层包覆膜的凝胶微球投入二价阳离子的等渗置换液中振荡0.5‑5min，等渗置换液的浓度为0.5‑10.0wt.％，使凝胶微球中的二价阳离子被置换，聚阴离子与二价阳离子的交联结构破坏，静置后除去上清液并用生理盐水洗涤，即获得包裹细胞和微纳颗粒的、用于微纳颗粒对细胞影响实验的微反应器。...

【技术特征摘要】
1.一种用于微纳颗粒对细胞影响实验的微反应器的制备方法，包括以下步骤：(A)预处理：将106-109个实验用细胞和0.1-2.0g微纳颗粒充分混匀于5-50mL的1.0-5.0wt.％的聚阴离子等渗溶液中形成粘稠混合液；(B)凝胶体系构建：采用静电微注射仪将A步的粘稠混合液滴入盛有20-200mL的0.5-10.0wt.％二价阳离子等渗溶液的收集池；静置5-20min后，过滤除去上清液并用生理盐水洗涤得到包裹细胞和微纳颗粒的凝胶微球；(C)络合成膜：将凝胶微球投入0.1-1.5wt.％的聚阳离子等渗溶液中，振荡5-15min；聚阳离子在凝胶微球表面形成一层聚阳离子包覆膜；静置后，过滤除去上清液并用生理盐水洗涤；随后投入0.1-0.5wt.％的聚阴离子等渗溶液中振荡5-15min，再在凝胶微球表面形成一层聚阴离子包覆膜；静置后，弃去上清液并用生理盐水洗涤；重复以上操作0-3次，得到具有2-8层包覆膜的凝胶微球；(D)液化反应：将C步得到的具有2-8层包覆膜的凝胶微球投入二价阳离子的等渗置换液中振荡0.5-5min，等渗置换液的浓度为0.5-10.0wt.％，使凝胶微球中的二价阳离子被置换，聚阴离子与二价阳离子的交联结构破坏，静置后除去上清液并用生理盐水洗涤，即获得包裹细胞和微纳颗粒的、用于微纳颗粒对细胞影响实验的微反应器。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：屈树新，刘玉梅，匙峰，高雪玲，刘阳，翁杰，
申请(专利权)人：西南交通大学，
类型：发明
国别省市：四川;51