猪H11位点的DNA片段及其应用制造技术

本发明专利技术提供了猪H11位点的DNA片段及其应用。上述的猪H11位点的DNA片段的序列如序列表中的序列1所示，该位点可用于构建猪定点突变库。在该位点插入基因安全性高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。在猪的基因组中定位H11这样安全有效的基因修饰位点，通过在细胞或个体水平上对猪H11基因进行敲除或修饰，以构建猪H11基因突变库,可为培育优良品系的猪提供前期技术支持。

【技术实现步骤摘要】
猪H11位点的DNA片段及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及能被定点插入的猪H11位点的DNA片段及其应用。
技术介绍
基因修饰主要是指利用生物化学方法修改DNA序列，将目的基因片段导入宿主细胞内，或者将特定基因片段从基因组中删除，从而达到改变宿主细胞基因型或者使得原有基因型得到加强的作用。基因修饰目前已经广泛应用于人类生活的各个领域，例如，在医学上，可以利用基因修饰的方法抑制某些病毒类宿主细胞内的病毒复制，从而达到治疗的目的；在农业上，利用基因修饰的方法，人们已经成功地改变了农作物和畜禽的生产特性，从而达到改良以及传播优良品种的目的。在基因修饰的过程中，通常需要进行目标基因的表达，那么就需要有一个载体去容纳你要的目标基因。而DNA编码密码子是3个一个。外源目标基因不能随便插入，否则不能正确表达，还会把原有的顺序弄乱，造成基因重排。插入位点就是可以插入基因的位点，在它那里插入外源基因，不会改变原有质粒的复制及表达，还能使自身有正常表达的机会。目前，使用较多的插入位点是Ros26位点，但是该位点为一个基因，其启动子为全身性广谱表达，难以做到组织特异性表达，因此需寻求一种更适宜的插入位点。2010年，斯坦福大学的SimonHippenmeyer及其研究团队在小鼠的第11号染色体上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点，命名为hipp11位点，简称H11位点。H11位点位于Eif4enif1与Drg1两个基因的间隙，与Eif4enif1基因的19号外显子和Drg1基因的9号外显子相邻，大小约5kb。H11位点由于位于两个基因之间，因此安全性较高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。实验证实Hipp11位点定点基因修饰的小鼠与野生型小鼠生长发育无区别。此外，H11位点由于其位于两基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的达到任务目标。如果在猪的基因组中定位hipp11这样安全有效的基因修饰位点，将有利于稳定转基因猪培育的技术体系。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术不足提供一个供基因插入的猪H11位点。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：所述的猪H11位点的核苷酸序列，如序列表中的序列1所示。进一步的，上述的猪H11位点的核苷酸序列，如序列表中的序列2所示。可进一步的，上述的猪H11位点的核苷酸序列，如序列表中的序列3所示。本专利技术的另一个目的是将上述基因位点用于构建猪定点突变库上。本专利技术的再一个目的是提供一种含有上述猪H11位点序列的试剂盒。本专利技术提供的猪H11基因位点由于位于两个基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的完成目的基因的定点插入。此外，在该位点插入基因安全性高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。在猪的基因组中定位H11这样安全有效的基因修饰位点，通过在细胞或个体水平上对猪H11基因进行敲除或修饰，以构建猪H11基因突变库,为培育优良品系的猪提供前期技术支持。附图说明图1为测序检测分析酶切载体结果图；图2为利用CRISPR/cas9靶向切割系统构建的绿色荧光蛋白定点插入猪H11位点后细胞PCR扩增鉴定结果图；以及图3A和图3B为阳性克隆的荧光激发图；其中图3A为可见光下的细胞显微观察图，图3B为紫外光下的细胞显微观察图。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的前提下，对本专利技术所作的修饰或者替换，均属于本专利技术的范畴。如
技术介绍
中所提到的，在培育猪的优良品种时，主要采用随机整合的方式使外源基因随机插入猪基因组中，为后续分析带来了麻烦，为了克服上述缺陷，本专利技术提供了一种能定点插入的位点序列，利用该位点可构建该位点的切割系统以及定点插入的打靶载体系统，该方法操作简单，同时能让外源基因稳定在H11表达，为转基因搭建了稳定的平台。下面将结合具体的实施例来说明本专利技术的有益效果。实施例1CRISPR/Cas9靶向定点切割系统的构建1、根据我们提供的猪H11位点序列，设计用于基因敲除的多肽靶点，如下：5’-TACTGAAATGTGACCTACTTTCTTATGTTCCTGGAAGTTTAGATCAGGGTGGGCAGCTCTGGG-3’，sgRNA靶位点位置1(命名为H11-sg1):5’-GTTCCTGGAAGTTTAGATCAGGG-3’，相对应的sgRNA序列中识别该靶点的核苷酸序列为5’-UGAUCUAAACUUCCAGGAAC-3’。sgRNA靶位点位置2(命名为H11-sg2):5’-AGATCAGGGTGGGCAGCTCTGGG-3’，相对应的sgRNA序列中识别该靶点核苷酸序列为5’-AGAGCUGCCCACCCUGAUAU-3’。2、sgRNA表达质粒构建使用唯尚力德公司的cas9/gRNA构建试剂盒(Catalog.No.VK001-01)完成构建，构建过程如下：(1)根据前面所述的两个靶点序列，设计相应的引物序列，由北京天一辉远公司合成，具体序列见表1：表1两个sgRNA靶点引物序列核苷酸名称序列(5’-3’)H11-sg1-FAAACACCGGTTCCTGGAAGTTTAGATCAH11-sg1-RCTCTAAAACTGATCTAAACTTCCAGGAACH11-sg2-FAAACACCGAGATCAGGGTGGGCAGCTCTH11-sg2-RCTCTAAAACAGAGCTGCCCACCCTGATCT(2)寡核苷酸二聚体(oligoduplex)的形成将合成的oligo分别稀释成10μM，分别按如下比例混合分别混匀后，按照如下程序处理：95℃3min；将样品管放在95℃水中使上述混合物由95℃到25℃缓慢冷却；再在16℃下处理5min，最终获得寡核苷酸二聚体-1。分别混匀后，按照如下程序处理：95℃3min；将样品管放在95℃水中使上述混合物由95℃到25℃缓慢冷却；再在16℃下处理5min，最终获得寡核苷酸二聚体-2。(3)寡核苷酸二聚体分别插入到载体中在以下反应体系中进行反应：充分混合后，室温(25℃)静置5min，获得载体Cas9/gRNA-H11-sg1。充分混合后，室温(25℃)静置5min，获得载体Cas9/gRNA-H11-sg2。(4)转化分别取步骤(3)的最终产物(载体Cas9/gRNA-H11-sg1、Cas9/gRNA-H11-sg2)5μL加入到刚解冻的50μLDH5a感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30分钟后，42℃热激90秒，冰上静置2分钟，直接涂于氨苄抗性的平板。(5)验证挑5个白色菌落摇菌，提取质粒DNA进行测序。测序引物为：5’-TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3’，得到Cas9/gRNA-H11-sg1与Cas9/gRNA-H11-sg2的测序结果，上述测序结果见序列表中的序列4和序列5。该结果表明，通过上述操作能顺利将编码sgRNA的DNA序列(即靶位点1和靶位点2的序列)插入到Cas9/gRNA载体骨架中。实施例2定点插入绿色荧光蛋白的方法借助实施例1中所述的根据靶位点1构建的CRISPR/Cas9靶向定点切割系统系统对猪H11位点本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪H11位点的DNA片段，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。

【技术特征摘要】
1.猪H11位点的DNA片段，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中的序列3所示。2.权利要求1所述的DNA片段在构建猪定点突变库上...

【专利技术属性】
技术研发人员：李奎，阮进学，杨述林，李和刚，牟玉莲，吴添文，魏景亮，徐奎，黄雷，周荣，刘楠，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11