本发明专利技术涉及一种水稻DNA片断的分离克隆、氨基酸序列优化以及功能验证及其应用。所述的DNA片断包含与水稻生长速度相关基因OsHRH，它赋予水稻植株的快速生长的能力。将该DNA片段与外源启动子序列连接后直接转入植物体，转基因植物植株的繁殖能力显著增加，分蘖能力显著增强，产量也得到相应的提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物生物
具体涉及一种水稻DNA片断的分离克隆、氨基酸序列优化以及功能验证及其应用。
技术介绍
水稻原产亚洲热带，在中国广为栽种后，逐渐传播到世界各地。按照不同的方法，水稻可以分为籼稻和粳稻、早稻和中晚稻、糯稻和非糯稻。我国科学家袁隆平对杂交水稻的研究作出了巨大贡献，被誉为“杂交水稻之父”。水稻所结子实即稻谷，稻谷(粒)去壳后称大米、香米、稻米.世界上近一半人口，都以大米为食。大米的食用方法多种多样，有米饭、米粥、米饼、米糕、米酒等。水稻除可食用外，还可以酿酒、制糖作工业原料，稻壳、稻秆，可以作为饲料。我国水稻主产区主要是东北地区、长江流域、珠江流域。属于直接经济作物。还是世界上三分之一人类的主食。植物利用光能将二氧化碳和水转变成碳水化合物并释放氧气的过程称为光合作用。光合作用是生物界赖以生存的基础，也是地球碳氧循环的重要媒介。叶片是高等植物进行光合作用的主要场所，在这个过程中，首先由位于叶绿体内的叶绿素捕获光能并传递到光合反应中心，从而开始了能量的转化过程。光合作用被认为是地球上最重要的化学反应，光合作用是作物产量形成的物质基础，90～95％的植物干重来自光合产物。而光合作用除了与光有关之外，植株的叶片的表面积作为光反应的主要场所，决定着生物质的产量的多少。因此，提高植株的整体繁殖能力对于提高水稻的产量具有积极的意义。提高水稻的产量一直是科学家孜孜不倦的追求，而增加植株的繁殖能力以及水稻的分蘖水平对于提高水稻的产量具有重要的意义。本专利技术克隆并优化得到了Os HRH基因，利用该基因进行水稻遗传转化并鉴定了转基因植株的繁殖以及分蘖能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是从水稻中分离克隆一个植株生长以及分蘖相关的完整编码区段的DNA片段，利用这个基因促进植物的伸长生长和/或提高植物的分蘖能力。这个基因被命名为Os HRH。本专利技术涉及分离和应用一种包含OsHRH基因的DNA片段，该片段赋予水稻植株的繁殖能力增强的能力和/或提高植物的分蘖能力。为了增强所述基因的效果，申请人对所述的基因片段进行基因的定点突变，从100个突变体中通过转基因实验证实有10个蛋白具有较好的实验效果，因此选择这10个具有较好效果的突变体蛋白。所述氨基酸片段如序列表SEQ ID NO：1-11所示。可以采用已经克隆的OsHRH基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本专利技术的基因或同源基因。同样，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本专利技术的OsHRH基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsHRH基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，可获得植株繁殖能力增强以及分蘖能力提高的转基因植株。本专利技术的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本专利技术的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。携带有本专利技术OsHRH基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2ndEdition)。可使用包括本专利技术的OsHRH基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育增加植物量植物品种。下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。具体实施方式实施例1：分离克隆包含有OsHRH基因区段的DNA片段以水稻品种“珍汕97”作为模板，并设计序列特异引物外加接头BamHI位点和XbaI位点。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序(ABI3730测序仪)，获得所需的全长基因cDNA，并得到了氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。该克隆被命名为pGEM-OsHRH。实施例2 OsHRH蛋白定点突变 将SEQ ID NO：1的蛋白质序列，通过设计引物，实现蛋白质序列中基因的定点突变。突变了100个突变体，并获得了相应的核苷酸序列并构建相应的pGEM-OsHRH突变载体。实施例3，OsHRH基因抑制表达、超量表达以及启动子表达载体的构建和转化为了能更好地阐明此基因的功能，申请人将其在水稻中抑制表达和超量表达，从转基因植株的表型来验证。抑制表达(RNAi)载体构建方法如下：首先根据“ymtdgml”靶点通过常规的设计方法设计了siRNA，合成所述的siRNA并构建RNAi载体。超量表达载体构建方法如下：首先将实施例1中以及实施例2得到的阳性克隆pGEM-OsHRH质粒用BamHI和XbaI双酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带不同启动子的遗传转化载体pC1301S。酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(按以及比：24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含OsRRG1基因的酶切片段和酶切后的载体做连接反应，转化大肠杆菌DH10β(菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体。遗传转化的载体pC1301S是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301基础上，在酶切位点EcoRI和SacI处引入广泛使用的组成型表达的烟草花叶病毒CaMV 35S启动子而得到的。通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法将其导入到水稻品种“中花11”(中国水稻研究所提供的一个公开使用的一个水稻品种)中(其它任意的水稻品种也能够达到相同的效果，再次不一一列举)，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化方法应用Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant J，6：271-282，1994)进行。上述农杆菌介导的遗传转化具体步骤的培养基如下所述：试剂配方：(1)试剂和溶液缩写：本专利技术中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-苄基腺嘌呤)；CN(羧苄青霉素)；KT(激动素或称细胞分裂素)； NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙 酸)；2，4-D(2、4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6m本文档来自技高网...
【技术保护点】
OsHRH基因的蛋白质序列，如序列表SEQ ID NO：1‑11任一序列所示。
【技术特征摘要】
1.OsHRH基因的蛋白质序列，如序列表SEQ ID NO：1-11任一序列所示。
2.编码权利要求1所述的蛋白质的DNA序列。
3.权利要求1-2任一项所述的蛋白质序列或DNA序列在增加植物...
【专利技术属性】
技术研发人员：纪清侠，
申请(专利权)人：纪清侠，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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